答：

寡核苷酸药物（Oligonucleotide）是一类由几十个核苷酸组成的，序列较短的核酸分子。其主要是通过基因沉默抑制靶蛋白的表达，从而实现治疗疾病的目的。

与传统药物相比，寡核苷酸药物具有多重技术优势，包括：（1）特异性高；（2）高效性；（3）长效性，降低给药频率；（4）研发周期短，临床转化与研发成功率相对较高；（5）靶点丰富，适应症广等。目前人工合成的寡核苷酸药物分类如图1所示。其中反义寡核苷酸（ASOs）、小干扰 RNA（siRNA）为临床中开发的寡核苷酸药物的主要形式。

全球首款反义核酸药物于1998年获批上市，开启了寡核苷酸药物上市的征程；全球首款siRNA药物Patisiran于2018年获批上市，更具有里程碑意义；近两年来已有四款siRNA药物陆续获批上市。截止目前，据统计全球已有超16款寡核苷酸药物获批上市，有超过400个化合物处于研发阶段。2023年，诺华研发的siRNA长效降脂药--英克司兰钠注射液（lnclisran）在中国获批上市。与PCSK9单抗相比，英克司兰钠在给药频率和患者用药成本方面都显示出了更大的优势，因此具有极高的性价比。此外，2023年年底瑞博生物与齐鲁制药签订授权协议共同推进抗PCSK9小核酸新药的开发与商业化。2024年新年伊始，瑞博再次传来好消息，与勃林格殷格翰携手共同开发小核酸创新疗法，未来必将掀起寡核苷酸药物研发热潮。

答：

目前寡核苷酸生物分析方法主要有定量PCR、杂交免疫、免疫荧光以及质谱检测等。定量PCR主要适用于分子量在25 mer以上的药物，其检测灵敏度可以到达pg/fg级别，特别适合给药剂量低，灵敏度要求高的项目；杂交免疫和免疫荧光适用于分子量在20-40mer左右的药物，杂交免疫一般灵敏度可以达到0.1ng/mL附近，免疫荧光一般灵敏度可以达到单位ng级别；质谱检测受限于前侧原理和分子量大小，主要适用于ASO和siRNA类型的药物，分子量在20 mer以下，其检测灵敏度约为0.5~5ng/mL。

答：

液液萃取法（LLE）是提取寡核苷酸最常见的一种方式，比较常用的萃取剂为苯酚-氯仿。在此基础上也可以进行优化，比如加入异丙醇进行沉淀，去除基质中的蛋白，降低基质效应。同时也需要根据化合物性质，调节pH值，比如加入氨水等，来提高寡核苷酸药物在水相中的溶解性。

固相萃取法（SPE）是提取寡核苷酸使用最广泛的处理方式。固相萃取的方法与色谱分离的原理相同，由于寡核苷酸药物极性很大，保留差，在固相小柱活化和淋洗的过程中均需要使用离子对试剂缓冲液，才能达到保留寡核苷酸和洗脱干扰基质的目的。目前市面上也有非常成熟的提取寡核苷药物的试剂盒，例如Clarity®OTX™萃取方案可有效去除掩盖目标寡核苷酸并影响分析结果的细胞碎片，包括蛋白质、基因组DNA和脂质。通过去除这些污染物，MS基线噪音可显著降低，从而简化定量生物分析的过程。但是SPE方法成本高，主要适用于组织样品提取过程中。

此外，寡核苷酸在聚丙烯管和玻璃容器中均存在非特异性吸附，这严重影响检测重现性和准确度，因此可以加入表面活性剂来降低或者消除这一影响。在前处理过程中选择合适的耗材和试剂，例如无RNA/DNA酶的枪头、离心管和纯水等，对于实验结果也会产生较大的影响。

寡核苷酸属于酸性强极性化合物，在一般色谱柱上很难保留。针对寡核苷酸色谱法主要有离子对反相色谱（IP-RPLC）、离子交换色谱（IEC）、亲水作用色谱（HILIC）。其中离子对反相色谱法最为常用，主要使用离子对试剂，其原理是带正电的离子对试剂会与带负电的寡核苷酸磷酸骨架在溶液中构成离子对，减少了寡核苷酸的净电荷并增加了其疏水性，此时疏水相互作用促成了寡核苷酸在离子对反相色谱中的保留；再者，离子对试剂依靠其疏水性烷基链可以吸附于反相色谱的固定相上以形成离子交换剂（Ion exchanger），此时静电相互作用将帮助寡核苷酸在反相色谱中的保留。离子对试剂的种类繁多，最常用离子对主要为基于乙酸胺试剂和基于六氟异丙醇（HFIP）的胺类离子对试剂。

寡核苷酸由于其特殊结构，每个磷酸二酯键上都带有1个酸性质子（PKa~1），这类化合物在ESI源负离子模式下响应较好。由于寡核苷酸含有多个核苷酸基团，在ESI源中发生去质子反应，在负离子模式下形成多重电荷离子，同时很容易结合金属离子，因此会分散质谱信号。此外随着寡核苷酸分子量的增加，其检测响应也会损失严重。因此对这类化合物需要优化质谱条件，改善多电荷分布，同时减少待测物在质谱分析加合离子形成。主要通过调节溶液pH值、阳离子浓度和有机溶剂组成，来消除或者降低上述因素的影响。在色谱分离中已经提及需要使用到离子对试剂，以及在一开始的方法开发阶段寻找子母离子也必须使用离子对试剂，否则很难找到对应的子母离子碎片，然后在此条件下再进行质谱参数的优化，可能会获得比较好的信号响应。

答：

目前在siRNA和ASO检测中，检测的基质类型主要有血浆、尿液、粪便和组织。不同的基质类其前处理方法影响很大，血浆样品主要使用LLE法即可轻松达到1-5ng/mL，尿液需要重点考虑非特异性吸附、基质效应和提取回收率的影响，可以使用表面活性剂减低吸附，调节样品pH值和引入蛋白（血浆或血清）来提高回收率。组织中药物检测对方法要求很高，组织样品一般在提取前需要加入蛋白酶K分解组织，组织提取液具有很强的基质效应和低提取回收率，目前常规使用SPE的方法来解决相关问题，但SPE在货期和成本方面不具优势。熙宁生物|精翰生物目前开创性使用LLE法检测组织中的药物浓度，其灵敏度可以达到10-20ng/mL，从耗材货期和成本，以及方法重现性等方面与SPE相比，有很大优势，完全满足组织样品的检测需求。此外组织检测中离子对选择对检测结果，特别是基质效应影响很大，需要优化质谱条件选择合适的离子对。

答：

熙宁生物|精翰生物拥有临床前、质谱平台、免疫分析平台、PCR平台等完备的技术平台，可以为寡核苷酸药物的生物分析提供从药效学、药代动力学、免疫原性、细胞因子到生物标志物检测的一体化服务。

目前，熙宁生物|精翰生物遵循GLP、GCP 和 GCLP 体系要求，服务药企寡核苷酸药物的分析需求。我们已凭借完备的技术平台支持了多个寡核苷酸药物的临床前和临床项目，涵盖病毒性疾病、心血管疾病、炎症类疾病、代谢类疾病（糖尿病）等诸多治疗领域，在寡核苷酸药物的生物分析上积累了丰富的经验，能够为客户提供极具性价比的解决方案。一直以来，熙宁生物|精翰生物致力于与客户紧密合作，共同推动药物成功上市，造福全球病患。我们坚信，通过不懈努力和不断创新，我们可以为这一目标贡献一份重要的力量。