小干扰RNA(small interfering RNA; siRNA)属于小核酸药物中重要的一种药物类型，也被称为短干扰RNA(short interfering RNA)或沉默RNA(silencing RNA)，是长度在20到25个核苷酸的双链RNA，在生物学上有许多不同的用途。

其结构如图1a所示，双链RNA由正义链和反义链组成，在3‘端有两个碱基的游离，未经修饰的siRNA在体内很快被降解，目前主要采用纳米递送系统（图1b）或者设计成GalNAc（乙酰半乳糖胺）-siRNA复合物（图1c）。SiRNA药物作用机理如图2所示，siRNA片段与RISC（RNA诱导沉默复合体）结合，RISC由Argonaute-2 （Ago-2）、Dicer和TAR-RNA-结合蛋白（TRBP）组成，然后RNA的两条链分开，其中一条链从复合物上分离，5'端双链稳定性最低的那条链被选择出来，稳定的并入沉默复合物中，可激活RNA干扰，与目标mRNA互补序列特异性结合实现mRNA降解。如图3所示，目前全球已上市5款siRNA药物，中国大陆暂无siRNA 药物上市，大多处于均临床和临床前研究阶段。

图1a

Lipid polymer NPs

图1b

图1c

图2

图3

基于LC-MS检测siRNA有诸多难点，比如化合物极性大，色谱保留弱，此外siRNA药物为双链结构，需要进行双链解链，检测单链浓度，因此需要将正义链和反义链在色谱保留上尽量分离，降低双链相互干扰的影响；由于药物容易被限制性核酸内切酶降解，因此需要重点关注稳定性问题。

在质谱检测方面，由于其检测局限性，对于分子量较大的siRNA药物，一般以多电荷形式呈现，此外强酸性化合物需要在负离子模式下进行，该药物还易与金属离子螯合，诸多因素导致了LC-MS检测siRNA在灵敏度方面具有巨大的挑战。常规的样品前处理（蛋白质沉淀、液液萃取、固相萃取）方法不能适用于siRNA药物提取，因此需要在提高提取回收率、前处理效率和结果重现性做出更多的努力，下面总结了相关实验内容。

一、 前处理

本实验采用液液萃取方法，如图4，该方法前处理简单，耗时短，重现性好，成本低廉，非常适合高通量的样品前处理。实验操作需在冰浴黄光下操作保证样品中待测物稳定性。

图4

二、线性、精密度和准确度

本实验线性范围为正义链5~2500 ng/mL，反义链5~2500 ng/mL，代表性标准曲线见图5a（正义链）和图5b（反义链），相关系数均r＞0.999。表明线性关系良好。

通过考察3个分析批，5个浓度质控样品，用以评估该方法的精密度和准确度。结果显示批内精密度和准确度（含LLOQ QC的所有浓度质控）准确度偏差范围为-7.6~10.1%、-8.5~9.3%，%CV最大值分别为7.3%、6.4%；批间精密度和准确度（含LLOQ QC的所有浓度质控）准确度偏差范围为-5.0~6.7%、-6.3~8.3%，%CV最大值为5.0 %、5.4%。

图5a

图5b

 三、选择性

选择性考察不同来源的空白基质以及高脂，溶血基质，评估空白基质对待测物和内标的干扰。同时考察了内标对待测物的干扰，图6a为空白基质图谱，图6b为定量下限和内标图谱。

图6a

图6b

此外本实验同时考察了不同个体间基质效应，高脂溶血基质效应，提取回收率、全血稳定性，以及基质中稳定性，包含短期稳定性、长期稳定性、处理后样品稳定性等，所有验证项目均满足接受标准后，表明该方法能用于后续的临床样品分析。siRNA质谱检测存在较大的技术挑战，若对该检测内容非常感兴趣可以关注熙宁生物于2023年02月23日进行的寡核苷酸药物质谱检测生物分析策略的视频直播回放，相信经过这场直播将会让您对该类型药物检测有更多的了解，解答心中的诸多疑惑。

四、结束语

熙宁生物质谱平台能够提供符合NMPA/FDA/OECD/EMA的各项生物样品分析服务，支持小分子药物、多肽、寡核苷酸、PROTAC以及ADC等大分子药物的方法开发、验证和样品检测。平台配备了多套高端液质联用系统和Watson LIMS在内的生物分析系统和软件系统以及各种先进辅助设备，可以满足各类型药物临床试验的检测需求，极大提高了实验效率和质量，更高效地帮助客户进行药品研发。