在前期文章《RNA-Seq—特应性皮炎分子机制研究的利器》中，对RNA-Seq在特异性皮炎分子机制研究中的作用进行了详细的阐述，可全面分析组织、血液、石蜡包埋切片（FFPE）等样本的mRNA表达情况，探究特异性皮炎（AD）的发病机制，尤其是相关免疫和炎症通路，如Th1、Th2、Th17、Th22细胞极化过程等。

熙宁生物|精翰生物持续关注行业最新研究方向与研究动态，在传统的Bulk RNA-seq的基础上，我们结合单细胞/空间转录组的细胞类型注释信息及各细胞亚群的特征基因集，基因差异表达分析、差异基因功能和通路注释、可变剪切变异分析和新转录本预测的分析的基础上，通过自定义基因集，进行基因集富集分析（GSEA）、基因集差异分析（GSVA）及细胞类型注释分析，从炎症及免疫的角度探究特异性皮炎患者用药处理前后的特征基因表达谱变化，评估药物的临床效果。

图1 基因集富集分析

Bulk RNA-seq与单细胞/空间转录组

普通转录组测序（Bulk RNA-Seq）是提取组织、器官、群细胞的Total RNA进行测序，得到的是一群细胞中单个基因的平均表达水平，用来比较不同个体或同一个体的不同组织间的表达差异，但对内部细胞异质性较强的系统，如肿瘤组织，很多异常细胞的基因表达的信息会丢失，但是成本较低，技术成熟、通量高。

单细胞转录组测序是在单个细胞水平上构建基因表达谱，能够反映细胞的异质性，但成本较高，测序深度较低，而且传统的单细胞测序技术需要分离组织，可能因失去组织背景而导致解释偏差。

空间转录组学对组织结构进行研究，能够检测疾病驱动下细胞在空间背景下的直接反应信号，有助于了解组织微环境，然而其分辨率达不到单细胞水平。

虽然不同转录组学在样本解析和数据分析层面存在差异，但是相互之间具有很强的互补性。

单细胞测序与Bulk RNA-seq一致性分析

对相同样本组织进行Bulk RNA-Seq与单细胞测序，可评估单细胞测序结果的准确性。Bernard T.l等采用此方法评估了单细胞测序数据和 Bulk RNA-seq 数据的表达相关性，结果发现，解离诱导基因 Fos、Jun、Socs3、HSPA1A、HSPA1B 等在两组测序结果中表达量接近，并且单细胞测序数据和 Bulk Seq 测序数据整体相关性为 0.71，两种基因表达谱具有较强的相关性。

图2 单细胞测序与Bulk RNA-seq一致性分析

单细胞/空转数据提供Bulk RNA-seq的特征基因集

近期，S. Eyerich等使用10X Genomics的空间转录组技术在冷冻和H&E染色的皮肤切片中检测基因表达，从31名扁平苔藓（LP）、特应性皮炎(AD)及银屑病患者样本中获得了62,000个皮肤转录组，通过与正常组织比较，发现IFNG、 IL13和IL17A分别在扁平苔藓、AD和银屑病的病变皮肤中高表达。研究者进一步将细胞因子转录阳性斑点与表皮中所有剩余斑点进行比较，由此确定974个IFNG相关、148个IL13相关和228个IL17A相关的上调差异表达基因集。

通过收集既往研究中单细胞测序定义疾病相关marker基因数据集，在Bulk-Seq中分析样本中基因集的富集情况（GSVA、GSEA），比较用药前后基因集变化，检测疾病进展，评估药物临床疗效。

图3 IL17A阳性的单细胞表达谱

单细胞测序与Bulk RNA-seq联合分析

联合分析可以对肿瘤组织的单细胞或空间转录组数据进行细胞群鉴定及亚群细分，探究不同细胞群间基因的表达异质性，获取与肿瘤相关的细胞群、通路、转录因子及特征基因集。对不同部位样本进行Bulk RNA-seq，可以分析重点基因marker 的表达量变化趋势，评估其对免疫及代谢通路的影响。

图4 不同亚群差异基因富集分析

Alexander S. 等对5位三阴乳腺癌患者的肿瘤组织进行单细胞测序，根据测序结果将癌症相关成纤维细胞(CTL)分为4个亚群，肌成纤维样CAF(MyCAFs)、炎症性CAF(iCAF)、分化PVL(dPVL）和不成熟PVL(imPVL），并获取每个亚群的特征基因集。为进一步探究不同基质亚群对免疫逃逸的影响，研究者计算了三阴乳腺癌患者Bulk RNA-seq数据集中myCAF、iCAF、dPVL和imPVL簇的特征基因集的平均表达与T淋巴细胞浸润(CTL)水平的相关性。结果表明，iCAF功能障碍特征基因集表达水平较低的患者中，CTL水平较高，可显著提高患者的存活率，而在iCAF功能障碍特征基因集表达水平高的患者中，CTL水平与预后没有相关性，这表明炎症性CAF(iCAF)在TNBC中驱动功能障碍的CTL中发挥了作用。

利用单细胞数据注释进行Bulk RNA-seq的细胞组成分析

与肿瘤组织微环境类似，皮炎患者的病变组织内部及周围往往聚集着大量的免疫细胞。这些免疫细胞之间，存在着千丝万缕，免疫细胞多种多样，即所谓免疫微环境或免疫浸润的分析，本质上，就是弄清楚肿瘤组织中免疫细胞的构成比例。

CIBERSORT技术基于线性支持向量回归的原理对免疫细胞亚型表达矩阵进行去卷积，利用单细胞RNA-seq数据，提取特征后，反推Bulk-seq各类细胞成分所占比例。

图5 细胞类型注释

PHA（植物血凝素）能促进有丝分裂和诱导干扰素分泌，是常用的T淋巴细胞活化诱导剂。对PHA刺激前后的PBMC进行Bulk RNA-seq测序，根据基因表达量进行细胞类型注释，可以看到(图5)，PHA刺激后的样本中调节性T细胞（Tregs）的比例显著增加，Treg 通过主动调节的方式，抑制存在于正常机体内潜在的自身反应性T细胞的活化与增殖，发挥免疫抑制和免疫稳态方面的特性。当T细胞活化增殖，刺激Treg细胞活化，扩增的Tregs能有效抑制基因应答，并诱导产生新的Treg细胞，以持续的方式放大了循环水平。

熙宁生物|精翰生物提供RNA-Seq测序服务，可整合单细胞转录组/空间转录组细胞类型注释数据，补充并完善特异性细胞类型及不同代谢通路的特征基因集，通过基因集富集分析、基因集差异分析及细胞类型注释分析，从多个角度评估药物对代谢通路及临床表型的影响，助力申办方开展药物作用机制研究和生物标志物研究。

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