根据世界卫生组织(WHO)的数据，癌症是全球人口死亡的第二大原因，每年近千万人死于癌症。由于具有高抗肿瘤特异性和较低的毒副作用等优良特性，双特异性抗体(bsAbs)和抗体药物偶联物(ADC)已经成为癌症治疗中的热门药物。目前，超过100种双抗和ADC候选药物正在接受临床评估。随着众多药企的加入，双抗和ADC的研发赛道竞争激烈，产品靶点同质化严重。在此背景下，开发出高效且具有差异化的产品成为药企们破局的关键，双抗ADC（bsADCs）应运而生。

PART 01

双抗ADC药物是一种将小分子细胞毒素（payload）通过连接子（linker）与双特异性抗体偶联形成的药物，能够有效将细胞毒性药物靶向递送到癌细胞区域，达到精准治疗的效果（图1）。双抗ADC可分为双靶点ADC（如EGFR/HER3 ADC）和双表位ADC（如HER2/HER2 ADC）两大类。相较于单抗ADC，双抗ADC的优势主要在于：

表1 双抗ADC全球在研项目

然而，开发双抗ADC药物的道路仍然布满荆棘。代表性的如Zymeworks 公司的Zanidatamab Zovodotin（ZW49），是一款识别HER2受体双表位的双抗ADC，在小鼠模型中显示出了优异的抗肿瘤活性，并且有着不错的临床安全性，遗憾的是临床数据不达预期，Zymeworks正在积极进行改进。而阿斯利康的MEDI4276，则是另一款母单抗与ZW49相同的HER2双表位ADC药物，尽管在Ⅰ期临床中展现了一定疗效，却因严重的毒性问题被终止开发。

客观地看，虽然双抗ADC有更好的疗效潜能，但也可能存在治疗窗口过窄和毒性叠加的问题。一款成功的ADC药物，必须把握好疗效与安全性之间的平衡。开发者们在考察药物疗效的同时，需要更多地探究双抗ADC的作用机制，并尽可能做好安全性评价。

临床生物分析是药物作用机制和安全性评价的重要一环。双抗ADC药物的临床生物分析主要包含药代动力学（PK）、抗药抗体(ADA)以及中和抗体(NAb)分析。

PART 02

双抗ADC药物的PK分析具有传统单抗ADC药物的特征，比如同样需要考察复杂的组分多样性、DAR值敏感性、靶点干扰和方法一致性，并根据药物的作用机制和试剂的可及性统筹设计。通常情况下，由于双靶点的存在，双抗ADC药物PK分析的试剂可及性要优于单抗ADC药物，甚至不需要抗体，仅用两个靶点蛋白即可搭建起一套检测方法。但是另一方面，双抗ADC药物也要承受双靶点带来的双份干扰问题，同时抗体的结构稳定性和检测断开的抗体的必要性也可能需要考察。总抗体和ADC优先考虑使用LBA方法检测而游离小分子毒素优先考虑使用LC-MS方法检测的原则，在双抗ADC药物的PK分析中仍适用，但具体采用何种方式检测哪几种组分还需具体项目具体分析。

以熙宁|精翰检测过的某双抗ADC药物为例，由于其与天然抗体大小相同、结构相近，无需考虑断开的抗体，此药物的PK分析方法与单抗ADC相近，共开发了3个方法检测3种形式，分别是LBA的方式检测总抗体和ADC，LC-MS检测游离毒素。在总抗体和ADC方法开发过程中，我们考察了DAR值敏感性（比较了不同试剂对以及不同试剂组合的差异），同时结合健康人以及受试者体内游离靶点蛋白的浓度水平，我们优化并考察了靶点干扰水平，最终开发了适合临床检测的生物分析方法。在使用LC-MS检测游离毒素方面，需要重点考虑ADC、游离毒素的稳定性，目前熙宁|精翰在面对不稳定ADC和游离毒素时，针对性地设计了不同的开发策略，通过定制特殊采血管的方式，在增加样品稳定性的同时，极大简化临床操作，提高了临床操作的依从性。

但阿斯利康的双抗ADC药物MEDI4276的PK分析则全部基于LC-MS/MS平台完成，总共开发了3个方法检测5种组分。与常规ADC药物一样，MEDI4276药物在体内也会经历毒素从完整ADC分子上解离的过程。但需额外注意的是，MEDI4276完整分子上的毒素是乙酰化的形式，其乙酰化位点在体内可能被去乙酰化，且去乙酰化的毒素既可以结合在抗体上形成去乙酰化的ADC也可以脱离抗体成为去乙酰化的游离毒素。相比于ADC药物PK分析一般检测总抗体、ADC和游离毒素三项的做法，MEDI4276需额外检测去乙酰化的ADC和去乙酰化的游离毒素。具体做法为：方法1. 利用抗药抗体亲和捕获 + 胰蛋白酶消化 + LC-MS/MS检测特征性肽段和游离毒素，定量总抗体和ADC；方法2. 利用抗药抗体亲和捕获 + 胰蛋白酶消化 + LC-MS/MS检测去乙酰化游离毒素，定量去乙酰化ADC；方法3. 利用蛋白沉淀 + 固相提取 + LC-MS/MS检测游离毒素和去乙酰化游离毒素。

图3 多样化的LC-MS/MS平台实现双抗ADC药物MEDI4276临床PK分析

PART 03

ADA样品分析的流程可分为初筛、确证、滴度和中和抗体分析。首先对样品进行初筛，初筛阳性的样品进行确证分析，确证阳性的样品进行滴度分析和中和抗体分析。鉴于双抗ADC药物结构的复杂性，通常会对ADA确证为阳性的样本进一步开展域特异性分析。推荐至少进行抗体端的域特异性确证，对于抗体端的不同表位、毒素和Linker则基于项目进展以及试剂储备等实际情况的考虑进行考察。同时，在方法开发阶段还需测试药物和靶点对阳性对照抗体信号的影响，可通过酸化、固相/磁珠提纯、PEG沉淀等方法提高药物耐受，利用竞争性的抗靶点抗体或靶点受体去除靶点干扰，实践中可根据实际情况灵活运用或尝试各种方式的组合。另外，高比例的ADC标记可能会增加ADC标记试剂的不稳定性，或者掩盖ADA识别表位，推荐在方法开发阶段进行不同标记比的测试和选择合适的试剂储存条件。最后，双抗ADC药物结构的复杂性还可能带来代谢产物的多样性，而不同的代谢产物也可能成为ADA的来源，因此开发的方法需尽量满足对包含主要代谢产物在内的药物ADA的检测。

以熙宁|精翰内部的某双抗ADC药物的ADA分析项目为例，此项目选择的是MSD平台，靶点干扰是其方法学面临的主要考验。经过多轮尝试，熙宁|精翰选择了利用抗靶点抗体去除靶点和酸化提高药物耐受的策略，成功克服了靶点干扰的问题。由于此药物结构较为稳定，所以建立方法时并未考察代谢产物的影响。

但阿斯利康的双抗ADC药物MEDI4276则相对复杂一些，由于毒素去乙酰化后可以形成去乙酰化的ADC分子和去乙酰化的游离毒素， MEDI4276的ADA分析考察了不同代谢产物的影响。MEDI4276的ADA检测采用等量的Biotin标记的ADC、去乙酰化ADC和裸抗共同包被作为捕获试剂，与样品孵育后，再用等量的Ru标记的ADC、去乙酰化ADC和裸抗混合作为检测试剂进行检测的方法。此方法可以在一个实验中完成对MEDI4276及其主要代谢产物抗药抗体的筛选、确证和滴度试验，方法灵敏度105.75 ng/mL。药物耐受方面，在100、1000、10000和100000 ng/mL的MEDI4276药物存在下，390、6250、25000和100000 ng/mL的阳性对照抗体仍可被检测到。

PART 04

对于ADA抗药抗体阳性的样本，通常需要进行中和抗体分析。推荐使用细胞平台进行双抗ADC药物的中和抗体分析，细胞学实验更能反映药物和中和抗体在体内的真实情况，也更符合法规的要求。细胞平台检测NAb首先要解决的是稳转细胞株，通常可以选用药物生物学活性实验中用到的细胞，如不可得，则可能需要多方查找筛选或个性化定制开发，并可能导致项目周期延长。此外，细胞学实验还存在很多困难，例如linker不够稳定导致信号窗口窄、灵敏度过低、酸性条件影响细胞活性、基质或药物干扰过大等。当细胞平台因为种种原因无法实现时，也可考虑采用 CLBA 平台检测。无论采用细胞平台还是CLBA平台进行NAb分析，都需要中和抗体作为阳性对照，而这正是NAb分析的另一个挑战。如果阳性抗体的中和活性不是很好，NAb分析方法的开发就会比较困难，极端情况下甚至可能导致项目无法继续推进。稳转细胞株和阳性中和抗体是NAb分析的关键试剂，开发耗时也较长，建议有检测需求的各方提前准备。

双抗ADC分为单靶点双表位和双靶点两类，这个区别可能导致NAb分析策略上的差异。如果是单靶点双表位ADC，其分析策略与单抗ADC相近，通常开发一个方法即可。如果是双靶点ADC，则可能需要针对两个靶点开发两个方法单独分析。此外，开发同时表达两个靶点蛋白的一个细胞系、建立一个方法整体分析也是可以尝试的方向。

PART 05

表2 熙宁生物|精翰生物ADC药物检测经验（部分）

参考文献：

[1] Maruani A. Bispecifics and antibody–drug conjugates: A positive synergy. Drug Discov Today Technol. 2018;30:55-61. doi:https://doi.org/10.1016/j.ddtec.2018.09.003

[2] 20231016-医药行业深度研究：再看ADC，布局全面、创新不辍，中信建投

[3] Pegram MD, Hamilton EP, Tan AR, et al. First-in-Human, Phase 1 Dose-Escalation Study of Biparatopic Anti-HER2 Antibody–Drug Conjugate MEDI4276 in Patients with HER2-positive Advanced Breast or Gastric Cancer. Mol Cancer Ther. 2021;20(8):1442. doi:10.1158/1535-7163.MCT-20-0014

[4] Faria, M, Peay, M, Lam, B, et al. Multiplex LC-MS/MS Assays for Clinical Bioanalysis of MEDI4276, an Antibody-Drug Conjugate of Tubulysin Analogue Attached via Cleavable Linker to a Biparatopic Humanized Antibody against HER-2. Antibodies 2019, 8, 11. https://doi.org/10.3390/antib8010011