前言

Tebentafusp是一款TCR/CD3双特异融合蛋白药物，靶向gp100表达的肿瘤，同时是首款以T细胞受体为骨架的大分子药物。根据Immunocore和Adaptimmune披露Tebentafusp的临床前的研究资料文献，笔者梳理了α-CD3为骨架的双特异药物需要进行临床前体外试验，以及以人的免疫细胞为核心的，种属特异性的体外试验对首次人体试验安全剂量的选择的重要指导意义，讨论临床前以人免疫细胞的体外试验模型取代非相关动物模型进行安全性、有效性评估和安全剂量预测的范式转移的可行性，梳理临床前体外试验包的主要内容。

Tebentafusp临床前体外试验

随着CTLA-4抗体, PD1/PDL1抗体，CART和CD3 based双特异药物在近10年不断获批上市并广泛应用肿瘤治疗领域，肿瘤免疫疗法已成为新的药物研发的范式，不断有肿瘤免疫相关的新靶点，新药物形式实体从临床前进入临床。在肿瘤免疫治疗药物研发迅猛发展的同时，也暴露出了一些风险，其中影响比较深远的是采用不合适的临床前的药物评估模型无法充分的预估临床副作用导致的安全性风险。比较典型的案例是抗CD28抗体TGN1412在健康受试者中引起的剧烈的危机生命的细胞因子释放综合征，CD3/CD19双抗药物blinatumomab在病人中发现的神经毒性等。究其原因是目前传统的临床前的动物模型用来预测人来源的免疫调节药物的安全性和有效性并不合适，动物/人的免疫细胞/免疫蛋白和治疗药物的互作强度存在差异，人来源的治疗药物在动物体内会产生抗药抗体影响到药代动力学分布，进而影响到安全性和有效性评估。      

ICHS6 和 ICHS9 强调药物的临床前研究需要确保药物在相关种属具备药物活性，如果做不到这点，可以考虑体外的方法。已经有越来越多案例表明人种属来源的体外试验能够产生有价值的，能够为体内预测提供有帮助性的结果，并且在临床阶段选择最低预期生物有效水平（Minimal Anticipated Biological Effective Level）的起始浓度非常有指导意义。

以Tebentafusp的临床前研究数据为典型案例，如下图1 Immunocore和Adaptimmune的 科学家介绍了在有效性，安全性和特异性方面进行评价临床前的体外方法的测试项。

                     图1：临床前体外试验测试项

临床前体外免疫学试验包分析

Tebentafusp的临床前体外免疫学试验包总结下来可分为以下内容：

有效性评估-体外人T细胞激活和杀伤，使用的方法分析

1. 基于人PBMC  Tebentafusp介导特异性的肿瘤细胞杀伤试验，采用的是LDH释放杀伤模型, IncuCyte 凋亡检测模型，结果间图2

2. 基于人PBMC和特异性的肿瘤细胞作用，Tebentafusp介导的T细胞的激活测定，采用的是ELISPOT检测IFNγ的T细胞激活性模型。

  图2：体外肿瘤细胞杀伤试验结果

通过细胞杀伤试验中Tebentafusp梯度稀释的剂量结果，确定Tebentafusp在1pM-1nM的范围内有有效的杀伤效果，确定最低预期生物有效水平为1pM.

安全性评估-体外人T细胞激活和细胞因子释放，使用的方法分析

1. 靶点特异性，非肿瘤特异性的活性测定。主要采用的是不同抗原表达丰度的肿瘤细胞，不同捐献者的黑色素细胞进行对比评估，使用ELISPOT检测T细胞的激活进行测试，结果见图3。Tebentafusp在比较敏感的受试者中药物浓度达到1pM-10pM会出现皮肤相关的副作用，在大部分受试者中10pM-100pM会出现皮肤相关的副作用，在1nM以上时会丢失特异性。

2. 非靶点，非肿瘤特异性的活性测定。主要采用的是在全血中Tebentafusp细胞因子释放，检测上清IL-6, TNF-α,IL-2 and IFNγ，文章没有描述方法的细节，笔者认为基于TGN1412案例中的方法2，从安全性角度来说，全血的刺激应包括，液相刺激，湿法固相刺激和干法固相刺激等模型。

 图3：靶点特异性，非肿瘤特异性的活性测定

基于体外安全性的结果过大于1nM Tebentafusp会特异性减弱，结合有效性的检测数据，最终确定的临床剂量扩展的范围在10pM-100pM.

总结讨论：

根据相关文献记载，与非人灵长类动物（NHPs）相比，人类T细胞激活后，具有更强的增殖反应。具体的原因可能是相对于非人灵长类动物，人的CD33相关的siglec糖蛋白有明显的下调。CD33-siglec糖蛋白轴具备抑制T细胞激活的重要调节功能，所以免疫调节剂特别是免疫激动剂在非人的灵长类动物模型中，其免疫激活能力将会被低估，使用灵长类动物模型的安全剂量外推到人体用量，有极大的安全性风险，这也是CD28超级激动剂在首次人体试验出现严重的临床试验的根本原因。

基于免疫调节剂的动物模型的非相关性，美国先后发表了An FDA oncology analysis of CD3 bispecific constructs and first-inhuman dose selection，An FDA oncology analysis of immune activating products and first-in-human dose selection两篇文章推荐使用基于人免疫细胞的更加具备相关性的体外试验模型的检测结果进行CD3双抗和免疫激动剂的人体首次用量剂量的外推。具体如图4

图4:FDA推荐使用体外的人免疫细胞试验的数据外推首次人体剂量

熙宁生物临床前体外免疫学试验服务

熙宁生物有非常丰富的临床前和临床阶段基于人免疫细胞的体外有效性和安全性评估的项目经验，建立了多个基于人免疫细胞的体外受体占位，细胞免疫杀伤/激活/增殖/细胞因子释放试验模型。可为包括CD3 Based双特异药物在内的免疫调节剂提供全套的临床前体外免疫学试验包，服务临床前安全性和有效性的评估，助力首次人体临床试验的安全有效剂量的选择。

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1.基于人PBMC的细胞杀伤肿瘤细胞检测：

2．基于流式细胞技术进行人全血的T细胞增殖测定和药物受体占位测定：

3. 基于ELISPOT平台药物作用下激活人PBMC激活的IFNγ检测

4.基于液相，湿法固相和干法固相刺激模型人PBMC/全血的细胞因子释放测定