前言

治疗性蛋白药物进入机体后，通常会诱导免疫反应的发生。对于大多数药物，不良免疫反应一般由体液免疫机制介导的免疫应答所致，因此抗药抗体（ADA）一直是定义该类药物免疫原性的主要标准。ADA可能通过影响治疗性蛋白与其靶点之间的药效学作用或改变其药代动力学特征而影响药效，某些情况下还可能引起严重的不良反应甚至危及患者生命。因此，生物分析方法必须具有足够的灵敏度和高度的特异性，以准确检测和表征 ADA。电化学发光桥连免疫分析法是检测ADA常用的方法之一，其灵敏度好，不受种属限制，可检测所有亚类ADA和除IgG4外大部分亚型，因此被广泛应用。然而，桥连法容易受到几种干扰分子的影响，如循环中的游离药物、药物靶点或血清中存在的其他因子（如类风湿因子）。正如高水平的药物会干扰 ADA 检测一样，当样本中的药物靶点以足够高的浓度存在时，也可能影响 ADA 信号，并可能干扰临床相关 ADA 的检测。常见的影响ADA检测的可溶性靶点分子包括：IgE，生长因子如血管生成素、神经生长因子和血管内皮生长因子，细胞因子如肿瘤坏死因子α、白细胞介素5，糖基化可溶性靶点和脱落的细胞膜蛋白等。靶点干扰可能会引起假阳性或假阴性，当可溶性靶点以可溶性二聚体或多聚体形式存在时，其可与捕获试剂和检测试剂桥连而产生假阳性信号；若可溶性单体靶点以足够高的浓度存在时，可与ADA竞争结合捕获试剂导致假阴性结果。由于药物对靶点的高度特异性以及每种靶点蛋白的高度可变的生物学特性，因此来自可溶性靶点的干扰是最难克服的。

可溶性靶点受体和辅因子蛋白的组合降低了猴血清样品中靶点介导的信号

作为靶点的天然结合伴侣，受体对靶点具有高亲和力，可与药物竞争靶点结合，从而有效缓解靶点干扰。可溶性靶点受体能够以剂量依赖性方式减轻靶点介导的信号（图 1A）。在 100 μg/mL 时，可溶性靶点受体有效阻断了猴血清样品中的靶点干扰（图 1A）。在体内，在许多情况下，受体蛋白与辅因子蛋白密切相关，辅因子蛋白有助于维持受体结构并提高其结合靶点的能力。将不同浓度的辅因子蛋白添加到 50 μg/mL 的可溶性靶受体中时，可进一步降低猴血清样品中的背景信号，当受体和辅因子浓度均为50 μg/mL时，降低靶点干扰的效果最为显著（图 1B）。在一组猴血清样本中，可溶性受体和辅因子蛋白的组合有效地抑制了靶点介导的假阳性信号（图 1C）。 除了一个样品（S1）的平均信号值仍有约350，其他所有样品的平均信号值都大大降低。虽然样品S1信号值高于其他测试样品，但添加可溶性受体及其辅因子仍然抑制了大约 80% 的信号。

Figure 1

Figure 1. The combination of the soluble receptor and co-factor proteins can mitigate target-mediated signal in monkey naive serum samples. (A) Soluble target receptor can also inhibit target-mediated signal in a naive monkey serum sample in a dose-dependent manner. (B) The soluble receptor and co-factor molecules functioned synergistically in inhibiting the target-mediated signal, with the combination of 50 μg/mL of the receptor and 50 μg/mL of the co-factor being the most effective. (C) Target-mediated signal in eight monkey naive samples can be inhibited by the combination of the soluble receptor (50 μg/mL) and the co-factor (50 μg/mL).

弱酸条件下可以抑制猴血清样品中的靶点干扰，提高靶点耐受水平

与中性 pH 条件相比，在酸性条件下（pH ∼ 6.0），药物REGN-Y与其靶点的结合亲和力大大降低（表 2）。为了测试弱酸性条件下是否也能抑制 ADA 检测中靶点介导的信号，在存在或不存在靶受体和辅因子及中性或弱酸性（pH ∼6.0）条件下，测试了四个猴血清样品。仅使用弱酸条件以及在中性pH条件下加入受体和辅助因子只能部分抑制猴血清样品的高背景信号值（图 2A）。只有在弱酸条件下（pH ∼6.0）加入靶点受体和辅助因子才能完全抑制靶点介导的信号（图 2A）。此外，弱酸性条件（pH ∼6.0）与靶受体/辅因子的组合也大大提高了靶点耐受水平（图 2B）。中性条件下，加入靶受体和辅因子，靶点耐受水平约为94 ng/mL， pH =6.5条件下，加入靶受体和辅因子，靶点耐受水平提高至约为380 ng/mL，当pH =6时，加入靶受体和辅因子，靶点耐受水平提高至5.0 μg / mL以上（图2B）。以上结果说明弱酸性的pH值有助于减轻靶点介导的信号。为了验证弱酸条件是否会干扰真实ADA的检测，在不同pH值条件下对ADA阳性兔血清样本进行分析。如图3所示，无论试验pH值如何，ADA 平均信号值都是相似的，这表明在这些样本中，弱酸性pH对ADA阳性反应的检测影响很小，甚至没有影响。

Table2

Figure 2

Figure 2. Mild acidic assay pH can help mitigate the target interference. (A) Both mild acidic assay pH alone (pH ∼6.0) and the combination of the soluble receptor (50 μg/mL) and co-factor (50 μg/mL) can partially inhibit target-mediated signal in four naive monkey serum samples (individual bars). The best inhibition was obtained with the combination of the soluble receptor (50 μg/mL), co-factor (50 μg/mL) and mild acidic assay pH (pH ∼6.0). (B) Target tolerance levels, measured using a serum sample spiked with the recombinant target protein, improved with acidic assay pH in the presence of 50 μg/mL of both the soluble receptor and co-factor.

Figure 3

Figure 3. Mild acidic assay pH has minimal impact on true anti-drug antibody detection. A similar polyclonal anti-REGN-Y anti-drug antibody signal was detected in an early rabbit bleed (∼30 days after immunization) regardless of assay pHs, indicating the mild acidic assay pH has minimal impact on the stability and/or the detection of a true anti-drug antibody response.

Figure 4

Figure 4. Schematic representation of the target interference mitigation strategy employed. (A) In the absence of the soluble receptor and co-factor, under neutral assay pH, the multimeric target protein will bind to both Bio-REGN-Y and Ru-REGN-Y and generate target-mediated signal. (B) In the presence of the receptor and co-factor, under a mild acidic assay pH, the target can no longer bridge the labeled drugs due to two different but synergistic effects. First, the acidic pH reduces the ability of labeled drugs to bind to any available target. Second, the receptor and co-factor sequester the target so it will not re-associate with the labeled drugs.

总结

除了使用靶点特异性封闭试剂外，改变检测 pH 值也可以在消除靶点干扰方面发挥重要作用。通过改变Asssay的pH值可直接影响二聚体或多聚体靶蛋白或改变药物与靶点的结合亲和力以减轻靶点干扰。在本文这项研究中，弱酸条件下可以部分抑制靶点介导的信号，这可能是在弱酸性条件下，药物与靶点的结合亲和力降低，一定程度上抑制了标记药物与靶点的结合。而在之前的一项研究中，弱碱性条件下也可以通过限制靶点与药物的结合和促进靶点-药物复合物的解离来帮助减轻二聚体靶点干扰。不同的 pH 条件可用于破坏或增强这些靶点封闭试剂、药物、ADA、药物靶点和标记的药物分子之间的各种相互作用，因此，要设计这种基于 pH 的Assay，需要仔细评估每个单独的 ADA 检测的特定pH 条件，了解靶蛋白的生物学特性以及不同 pH 条件下的靶点与药物相互作用，以确保选择合适的测定条件以减轻靶点干扰且不会干扰真实ADA的检测。

尽管使用可溶性靶点受体可以非常有效地抑制靶点干扰，但仍有一些潜在的问题需要考虑。如受体制备技术有限，体外无法生产出和天然受体完全相同的重组受体，导致无法和可溶性靶点有效结合；药物与靶点亲和力极高，靶点很难与低亲和力的受体结合。由于样品中的天然靶点蛋白可能与重组版本不同，因此有必要测试实际给药后样品来评估靶点缓解策略的有效性。由于给药后靶点受体从细胞膜脱离水平增加、内在负反馈机制导致可溶性靶点分子分泌增多、靶点分子与药物结合导致清除减慢等原因，给药后样品中的靶点水平可以增加到相当高的水平，因此，为了确保在存在较高靶点浓度的情况下减轻靶点干扰，通常需要使用过量的靶封闭试剂。因此，需要考虑是否能生产足够的可溶性靶点受体以支持大型临床研究的需求，并结合受体的生产成本进行考虑使用该法的必要性。

参考文献

1.Zhong ZD, Clements-Egan A, Gorovits B et al. Drug target interference in immunogenicity assays: recommendations and mitigation strategies. AAPS J. 19(6), 1564–1575 (2017).

2.Chen J, Garlits J, Dhulipala G et al. Mitigating target interference in bridging immunogenicity assay with target-blocking reagents and mild basic pH. Bioanalysis 11(17), 1569–1580 (2019).

3.Chen J ,  Kendra K ,  Torri A , et al. Overcoming multimeric target interference in a bridging immunogenicity assay with soluble target receptor, target immunodepletion and mild acidic assay pH[J]. Bioanalysis, 2020, 12(15).

4.Mire-Sluis AR, Barrett YC, Devanarayan V et al. Recommendations for the design and optimization of immunoassays used in the detection of host antibodies against biotechnology products. J. Immunol. Methods 289(1-2), 1–16 (2004).

5.Shankar G, Devanarayan V, Amaravadi L et al. Recommendations for the validation of immunoassays used for detection of host antibodies against biotechnology products. J Pharm Biomed Anal 48(5), 1267–1281 (2008).