免疫检查点抑制剂成功用于肿瘤疾病的治疗，刺激了广泛的针对免疫调节靶点的研究热情，包括针对T细胞共刺激受体的激动剂，例如OX40，4-1BB，GITR , ICOS等靶点。与免疫检查点抑制剂，需要对靶点完全和持续的受体占位率才能最大程度的发挥药效不同，对于免疫检查点激动剂类药物，什么才是最佳给药方案？多少的受体占有率才能发挥最大药效？这些都有待于更多的研究。

众所周知，对于免疫检查点抑制剂，PD-1，PD-L1，TIGIT等靶点，受体占位率的研究是临床PD研究的标准配置之一。更多关于受体占有率检测的背景信息，请参考熙宁/精翰微信公众号平台，熙宁小课系列：基于流式细胞术的大分子药物受体占位研究。

为了解决临床研究过程中，临床中心分离PBMC耗时耗力，需要配置相关设备和人员的矛盾；为了解决随采集随运输的高运费，随到随检的高检测费用，精翰生物经过不懈的努力，开发并验证了基于冻存外周血全血的实验方案，并在包括PD-1，PD-L1，TIGIT，CD19, CD20, CD73 等一系列靶点上进行了验证，成功用于临床样品的分析，极大的方便了临床样品采集和并减少了样品分析的费用。更多的信息，请请参考熙宁/精翰微信公众号平台，熙宁小课系列：大分子受体占位检测，使用冻存全血，您想尝试一下吗？

对于免疫检查点激动剂，远比抑制剂要复杂的多，本文以OX40靶点为例，分享BMS-986178临床前和临床的一系列研究，与诸位同行探讨单抗类激动剂药物，应该如何进行哪些转化医学的研究，助力药物的开发。

根据激动剂类药物的作用过程和机制，可以作为PD指标的检测主要包括：

一、受体激动剂类的单抗与靶点结合（受体占位率的检测）；抗体与靶点结合后，可能引起靶点表达水平的调节（靶点在细胞表面的表达水平）；

如图1的 A所示，测试了OX40在第8天和第13天，单独给药以及与PD-1联合给药，三个不同的剂量下（0.03，0.3，3 mg/kg）在外周血和肿瘤Treg亚群上的受体占有率，可以看到随着给药剂量的增加，受体占位率增加，第13天与第8天相比，受体占有率有不同程度的降低；如图1 的B和C所示，与PD-1联合给药的两个不同的剂量下（0.5，5 mg/kg），在第10天，第17天和第23天的OX40受体占有率和OX40的表达水平，可以看到5mg/kg组相比0.5mg/kg 组，受体占位率更高一些；且随着给药时间的延长，OX40的表达量增加。如图2的A所示，在人体试验中20，40，80，160，320mg在给药后的C1D8和C2D1基本都能保持80%以上的受体占有率，但是与动物实验不同的是，给药后OX40的表达水平，在人体试验中是降低的，而在动物实验中是增加的。此外，如图3所示，使用人CD4+T细胞进行了OX40 受体占位率，OX40受体表达水平，T细胞增殖的相关研究，研究表明，随着受体占位率的增加，在受体占有率达到40%以上时，OX40的表达水平开始降低。

图1 抗鼠OX40抗体的动物实验数据

图2 抗人OX40抗体的人体实验数据

图3 抗人OX40抗体受体占有率和表达水平

二、抗体与靶点结合后，可以刺激T细胞的激活，进行细胞进行增殖（细胞亚群的检测，T细胞表面的激活指标，如CD69，HLA-DR，4-1BB, ICOS等指标，以及反映细胞增殖的核内转录因子Ki67或者直接测定血液中细胞亚型以及细胞因子，比如IFN-γ的浓度）。

如图4，所示，OX40抗体单独给药，OX40与PD-1抗体联合给药或者OX40与CTLA-4联合给药情况下，Ki67阳性细胞亚群占CD4T和CD8T细胞亚群的比例，可以看到明显的Ki67%占比随着OX40给药剂量的增加而增加。另外，从表1可以看出，Ki67%细胞在CD4+ effector memory细胞亚群和CD4+ effector-like亚群，IFN-γ，IP-10和CXCL10三个细胞因子，在OX40与PD-1抗体联合给药或者OX40与CTLA-4联合给药情况下，很多检测点的结果与C1D1相比，都显示出非常明显的差异。

图4 OX40抗体在CT26动物模型中的结果

表1 外周血细胞亚群分析和外周血细胞因子分析

经过以上的分析，我们可以知道对于OX40这个靶点，药物浓度越高，受体占位率越高，但是OX40的受体表达量，细胞因子分泌，T细胞增殖缺并非药物浓度越高越好，因此什么样的给药剂量，什么样的给药间隔是最合适的，还需要更多的研究，尤其是临床研究的相关结果。

图5  BMS-986178药物剂量与OX40受体占位率，OX40受体表达

的药代动力学-药效学的转化模型

单抗激动剂药物虽然已经经过了30多年的发展，但是至今没有一个在售的药物，单抗激动剂药物相比免疫抑制剂类的药物，无疑需要克服更多的挑战，因此在单抗激动剂药物的临床和临床前研究中，需要更多的生物分析工作的支持。熙宁生物在支持激动剂类药物的临床分析中，已经积累的大量经验，已经完成和正在进行的临床研究有十余个。已经积累了丰富的经验，主要包括：

1.基于流式细胞术的淋巴细胞亚群分析，具体包括T, B, NK, Mono等亚群的占比和绝对数量分析; Treg 亚群分析；T cell EM，CM等亚群分析；

2.基于流式细胞术的T细胞激活指标分析，包括4-1BB，CD69，HLA-DR，CD25等亚群占比分析；

3.基于流式细胞术的细胞增殖分析，包括Ki67+占比分析和EdU+细胞阳性率分析；

4.基于流式细胞术的受体占位率分析；

5.基于流式细胞术的受体表达量分析；

6.基于MSD，ELISA，Luminex和CBA的细胞因子分析；

7.基于ELISPOT的T细胞，B细胞激活分析。

参考文献：

Wang, R., Gao, C., Raymond, M., Dito, G., Kabbabe, D., Shao, X., … Quigley, M. (2019). An Integrative Approach to Inform Optimal Administration of OX40 Agonist Antibodies in Patients with Advanced Solid Tumors. Clinical Cancer Research. doi:10.1158/1078-0432.ccr-19-0526