1.简介

蛋白质甲基化

蛋白质甲基化一般指精氨酸或赖氨酸在蛋白质序列中的甲基化，是翻译后修饰的一种形式。精氨酸可以被甲基化一次（称为一甲基精氨酸）或两次（精氨酸甲基转移酶（PRMTs）将两个甲基同时转移到精氨酸多肽末端的同一个氮原子上成为非对称性甲基精氨酸，或者在每个氮端各加一个甲基成为对称性二甲基精氨酸），赖氨酸经赖氨酸转移酶的催化可以甲基化一次、两次或三次。组蛋白甲基化是指发生在H3和H4组蛋白N端Arg或Lys残基上的甲基化，由组蛋白甲基转移酶介导催化。某些组蛋白残基通过甲基化可以抑制或激活基因表达，从而形成为表观遗传。

H3K27me3

组蛋白H3第27位赖氨酸三甲基化（Trimethylated Histone H3 at Lysine 27）是最常见的组蛋白甲基化修饰之一，由多梳抑制复合物2（Polycombrepressive Complex 2，PRC2）产生，而PRC2组成部分的改变，如Zeste基因增强子人类同源物2（Enhancer of Zeste Homolog2，EZH2）功能改变或过表达会使H3K27me3表达失衡，细胞增殖分化失控，导致肿瘤发生。EZH2是多梳蛋白家族（Polycomb Groups，PcG）的核心催化亚基，通过组蛋白甲基的一个高度保守区域SET催化组蛋白H3K27发生甲基化，从而使抑癌基因表达下调。

H3K27me3的检测方法

目前H3K27me3检测方法主要有Western Blot、免疫组织化学（IHC）、染色质免疫沉淀-测序（ChIP-Seq）、流式细胞术（FCM）等，其中FCM具有分析能力强和多参数的特点，可同时检测到H3K27me3水平在多个细胞群中表达量的差异。目前，FCM多与Western Blot联合用于EZH2抑制剂的药效学研究，评估该类型药物对多个细胞群组蛋白甲基化水平的影响。随着细胞通路研究的深入，FCM有望在单细胞水平直接检测胞内H3K27me3的表达水平。

流式细胞术（Flow Cytometry）

是一种对细胞群体中的单个细胞或类似细胞大小的颗粒进行快速、连续检测的技术。其基本原理是：细胞或其他微粒与相应的荧光素偶联蛋白或抗体结合，基于层流规律的流体动力学聚焦样本形成单细胞流，将单细胞队列快速传输至激光光源与液流正交的位置时，在特定波长的发射光源激发下，形成多角度散射光，和细胞携带的各种荧光染料被激发发出特征荧光，这些光谱能够被机器的信号接收器接收，通过光电转换器，将光信号转换为电信号。仪器收集、和测量众多单细胞的散射光和荧光信号并进行关联分析。

流式细胞术应用广泛，包括细胞亚群比例及浓度测定、细胞功能分型（活化、耗竭、分化时态、免疫检查点等）、细胞功能相关实验（细胞增殖、凋亡、周期、钙流、杀伤、吞噬功能等）、胞内染色（胞内因子、核内因子、胞内活化激酶等）、分泌细胞因子检测（流式液相多重蛋白定量CBA技术）、微生物学检测（细菌、真菌、病毒等鉴定，微生物活性等）、表观遗传学相关检测等。

基本检测原理

使用荧光素偶联的抗H3K27me3抗体和抗Total H3抗体，通过流式分析H3K27me3/Total H3的MdFI比值，反应细胞甲基化的强弱。且通过标记不同细胞亚群，评估给药后的甲基化变化情况，结果更具有代表意义。

图1：流式设门图举例

图2：人外周血中甲基化基线水平示意图

2. H3K27me3检测用于临床早期药效评估

在临床转化医学研究过程中，人外周血作为最容易获取的生物基质，是用于进行临床早期用于评价药理药效的作为重要的生物基质。根据已上市EZH2抑制剂药物Tazemetostat披露的研究资料，采用流式细胞术方法检测进行用药后人外周血中特定细胞亚型的H3K27me3水平，如图3所示，Tazemetostat用药后，在中性粒细胞和单核细胞中，H3K27me3水平有明显的下降，而在T细胞中，H3K27me3水平没有明显变化。

图3：Tazemetostat对PBMC中不同亚型细H3K27me3水平的影响

3. 常用的标本类型和处理方法

人外周血：抗凝采血管进行采集，样品经裂红、固定、破膜等处理后，可于-70℃中长期保存、批量分析。对样品运输时效要求相对较高，临床中心具备相关处理能力时，可节省运输成本，但需保证各临床中心操作的一致性。

4. 实验流程

本文阐述释通用型方法验证的相关实验流程，即使用抗凝全血进行H3K27me3相关检测流程。

01采集适量新鲜的抗凝全血。

02取出适当体积的新鲜全血，加入适当体积的细胞裂红固定液进行裂红、固定，洗涤，破膜。

03破膜后的样品可用于检测或转入冻存管中于-70℃冰箱长期保存。

04封闭液封闭，表面/胞内/核内抗体孵育。

05上机，使用流式细胞仪进行样品检测。

5. 精翰生物部分测试数据展示

1.室温储存稳定性数据

以上仅为某个方法开发数据举例，在不同细胞亚群中稳定性结果有差别，至48小时，T/B/NK/粒细胞/单核稳定（%CV＜35%），其中，粒细胞、单核细胞指标，至72小时稳定。

图4：粒细胞中测试结果示意图（MdFI信号比值）

图5：单核细胞中测试结果示意图（MdFI信号比值）

2.破膜后-70℃冻存稳定性数据

以上仅为某个方法开发数据举例，采集全血样品，经裂红固定、Perm处理后，-70℃冻存保存2个月MdFI比值在T/B/NK/粒细胞亚群中均较稳定。

图6：-70℃冻存储存2个月稳定性数据示意图，更长时间的冻存稳定性待测试

6.应用

H3K27me3是SCLC化疗耐药性的潜在治疗靶点：在一项小细胞肺癌（SCLC）化疗机制的研究中发现，H3K27me3可通过调节HOX转录反义RNA（HOTAIR）促使HOXAI DNA 甲基化进而诱导SCLC的多药耐药性。

H3K27me3是肿瘤治疗的重要预后指标：在一项鼻咽喉癌（NPC）放化疗后的研究中发现，H3K27me3的高表达与NPC患者的生存期缩短密切相关，提示H3K27me3可作为预测NPC放化疗反应和患者预后的免疫标志物。然而，在结肠癌化疗中发现，H3K27me3的低水平预示着治疗效果差。对于不同肿瘤而言，H3K27me3在治疗中显示出的表达上调或者下调所代表的的意义并不一致，需要结合具体作用机制综合分析。同样，使用H3K27me3进行预后分析时，也有相似情况。例如H3K27me3的表达缺失与乳腺癌、卵巢癌和胰腺癌患者的预后不良有关。与之相反，有研究者发现H3K27me3在肝细胞癌的高表达与血管浸润密切相关，并预示患者的预后差。

此外，H3K27me3作为生物标志物在相关表现遗传新药的开发和评价中也具有重要意义。例如通过细胞的高通量筛选法，以H3K27me3为靶点从329049个化合物中鉴定出EZH2介导基因沉默的新药NPD13668。在EZH2选择性抑制剂EPZ005687对多巴胺能神经元发育的研究中，发现该药物可抑制H3K27me3并增强神经元的分化等。在EZH2抑制剂的临床药物研究中，进行H3K27me3水平的检测，是在临床早期进行EZH2抑制剂药理药效研究最为重要的手段，同时该检测结果还可为II期临床实验最优药物剂量的选择提供重要依据。EZH2抑制剂可基于H3K27me3水平的药效学数据，结合最大耐受药物剂量数据，选择合适的药物剂量以达到最佳药效，并降低毒副作用，助力更加精准的转化医学研究。

参考文献：

1. 流式细胞术-原理、操作及应用，陈朱波、曹雪涛著，科学出版社出版。

2. Mutation of A677 in histone methyltransferase EZH2 in human B-cell lymphoma promotes hypertrimethylation of histone H3 on lysine 27 (H3K27). Michael T. McCabe, Alan P. Graves，et al.DOI:10.1073/pnas.1116418109.

3. H3K27me3在肿瘤中的研究进展，徐静纯，王 聪，南京医科大学学报（自然科学版）。

4. CDYL promotes the chemoresistance of small cell lung cancer by regulation H3K27 trimethylation at the CDKNIC promoter[J]. QIU ZG, ZHU WL, MENG H, et al. Theranostics, 2019, 9(16):4717-4729.

5. Systematic comparison of monoclonal versus polyclonal antibodies for mapping histone modifications by CHIP-Seq[J]. BUSBY M, XUE C, LI C, et al. Epigenetics Chromation, 2016, 9:49.

6. Poster, Chromatin Flow Cytometry Based Assessment of H3K27me3 Pharmacodynamics in Blood from Diffuse Large B-Cell Lymphoma (DLBCL) and Follicular Lymphoma (FL) Patients Following Exposure to the EZH2 Inhibitor Tazemetostat Reveals Disparate Response Profiles in Specific PBMC Subpopulations.