随着肿瘤免疫疗法的兴起，免疫系统在肿瘤研究中的作用受到了极大的关注。免疫系统的一些组分或其变化，已被用于肿瘤预后或预测肿瘤免疫治疗的疗效。例如，肿瘤浸润淋巴细胞的存在被证明与一些癌症的良好预后直接相关^[1]。然而，尽管一些患者存在高丰度的肿瘤浸润性淋巴细胞，但并不能保证有良好的疗效。因此，需要更深入地了解肿瘤组织中免疫细胞的类型及其激活状态、功能和特异性。作为适应性免疫的关键细胞效应器，T细胞的抗原特异性由T细胞受体（TCR）决定，这意味着TCR库（TCR repertoire）可以反应人类免疫系统的状态^[2]。因此，TCR库被认为是一种有前景的生物标志物，对TCR库的研究有助于表征肿瘤细胞与宿主适应性免疫系统的相互作用，指导如何利用现有或新的治疗方法有效地调节免疫反应，以及如何更好地预测肿瘤预后。

PART 01

在一项研究中，Charles等采用半定量多重PCR方法对44例I-IV期黑色素瘤患者的外周血和其中7例患者的转移性淋巴结样本的TCR库多样性进行了研究，并探讨其对临床预后的潜在预测价值^[3]。作者使用两个参数对TCR多样性进行量化：反映V-J重排数量的多样性丰富度（diversity richness，DR）和反映种群克隆性的多样性均匀度（diversity evenness，DE）。作者根据DR和DE值分析患者的无进展生存期（PFS）和总生存期（OS），发现患者外周血中较高的TCR库多样性（DR和DE参数）与较长的PFS相关，而多样性对患者OS没有显著影响（PFS和OS均从采样时间开始计算）（图1）。作者还进一步比较了7例患者血液和淋巴结转移瘤中TCR库的多样性（图2）。尽管总体DR和DE值在血液和肿瘤之间无显著差异，但对个体进行分析发现，患者1在血液和肿瘤中均具有最低DR值，肿瘤中具有最低DE值，在采样后疾病进展迅速并在采样四个月后死亡；相反，具有良好预后和较长生存期（接近4年）的患者8在血液和肿瘤中均表现出更高的TCR库多样性。综上，这项研究表明黑色素瘤患者血液和肿瘤中TCR库的多样性具有潜在的预后价值。

图1  DR和DE参数的数值高预示更长的PFS^[3]。通过ImmunTraCkeR®评估黑色素瘤患者血液中TCR库的多样性，并评估其对临床结果的影响: (a) 低DR值 (<90%, n="12)和高DR值">90%, n = 32)患者的PFS (左图)和OS (右图)对比; (b) DE值低于或高于中位数的患者的PFS (左图)和OS (右图)的对比(n = 44)。采用log-rank检验进行分析

图2  淋巴结（LN）转移瘤的多样性可能为临床结果提供有用信息^[3]。通过ImmunTraCkeR^®评估黑色素瘤患者血液和淋巴结转移瘤中TCR库的多样性（计算多样性丰富度和均匀度）。血液和淋巴结DR值(左图)和DE值(右图)的对比

除了黑色素瘤，TCR库对于乳腺癌、宫颈癌、胃癌等恶性肿瘤同样具有一定预后价值（表1）。总的来说，更高的TCR多样性意味着免疫系统具有更好协调抗肿瘤反应的能力，所以在健康个体或疾病进展较好的患者中，TCR库的多样性会更高。

表1  TCR库多样性在肿瘤预后中的作用^[1]

PART 02

免疫检查点抑制剂（ICIs）的使用已被证明可以提高多种类型肿瘤患者的生存期。到目前为止，用于预测ICIs疗效的生物标志物主要包括PD-L1表达、肿瘤突变负荷（TMB）和肿瘤浸润T细胞。近年来，一些研究试图探索TCR库多样性和克隆性的改变与ICIs治疗期间建立的保护性肿瘤特异性反应之间的关系，主要集中在靶向CTLA-4和PD-1的单克隆抗体这两类ICIs对TCR库多样性的影响（表2）^{[1, 4]}。由于难以获得纵向肿瘤组织样本，这些研究大多使用循环T细胞，少数使用肿瘤浸润T细胞。

表2  不同肿瘤研究中ICIs治疗后的TCR库分析^[1]

在一项试点研究中，Postow等人分析了12例转移性黑色素瘤患者在接受ipilimumab（anti-CTLA-4 antibody）治疗前的外周血TCR库多样性，以确定治疗前TCR库多样性是否与ipilimumab治疗的临床结果相关^[5]。作者通过丰富度（richness，观察到的V-J重排）和均匀度（evenness，特定V-J重排频率之间的相似性）这两个参数来研究TCR库的多样性。临床获益通过ipilimumab开始治疗后肿瘤负荷减轻或疾病稳定时间延长至少9个月的证据来确定。结果显示（图3），有无临床获益的患者在TCR库丰富度（p = 0.033）和均匀度（p = 0.028）上都存在显著差异，低丰富度（n = 0/5, p = 0.081）和低均匀度（n = 0/7, p = 0.01）患者均没有临床获益。该研究表明，转移性黑色素瘤患者外周血中基线TCR多样性与ipilimumab治疗的临床结果相关。

图3  A，有临床获益的患者在基线时TCR库的丰富度更高(p = 0.033)；B，有临床获益的患者在基线时TCR库的均匀度更高(p = 0.028)^[5]

此外，一些研究发现抗CTLA-4治疗可以增加外周血中TCR库的多样性。例如，为了评价tremelimumab阻断CTLA4对PBMC的免疫调节作用，Robert等人利用NGS评估了21例转移性黑色素瘤患者在接受tremelimumab治疗前、治疗30天和60天后，PBMC细胞中TCR V-beta CDR3的变化^[6]。结果显示（图4），接受tremelimumab治疗后，19例患者TCR V-beta CDR3的unique productive sequences中位数增加了30%，另外2例中位数下降30%；治疗后的丰富度（P < 0.01）和Shannon多样性指数（P < 0.04）变化显著。相比之下，从4名健康人的TCR V-beta CDR3多样性在1年内没有显著变化。这项研究说明用tremelimumab阻断CTLA4可以使外周T细胞库多样化，阐明这类抗体如何调节人类的免疫系统。

图4  Unique productive sequences绝对数值的变化^[6]。A，来自21名黑色素瘤患者(GA，黑色)和4名健康人 (HD，灰色)的基线和tremelimumab治疗后样本之间的变化。B，标准化的TCR V-beta CDR3库多样性。分析比较PBMC样本的基线和tremelimumab治疗后CDR3库的变化，这些数值进行归一化，以可比性的方式显示治疗后的增加和减少

关于抗PD-(L)-1治疗，一些研究也证明了更高的基线外周TCR库多样性与临床获益之间的关联。例如，Han等人对NSCLC患者PD-1+ CD8+ T细胞的TCRβ CDR3进行测序，以研究其在预测NSCLC患者对抗PD-1/ PD-L1治疗反应中的作用（图5）^[7]。两个独立的队列（队列A，n = 25；队列B，n = 15)分别作为发现组和验证组。在队列A中， ICB治疗前PD-1+ CD8+ T细胞TCR库多样性高的患者对ICB治疗表现出更优的临床响应和更长的PFS（6.4个月vs 2.5个月，HR，0.39；95%[CI]，0.17-0.94；P = 0.021）。类似的结果在队列B中也得到了验证，说明外周血PD-1+ CD8+ T细胞中的TCR库多样性可以作为预测NSCLC对ICB治疗结果的生物标志物。

图5  TCR库多样性与PD-1或PD-L1抑制剂治疗的反应和PFS的相关性^[7]。A，队列A中PD-1/PD- l1抑制剂治疗后DC和PD亚组PD-1+ CD8+ TCR多样性的比较(n = 25)。B，使用ROC曲线队列A中区分PD患者和DC患者(n = 25)。C，队列A的PFS通过PD-1+ CD8+ TCR库多样性进行分层(n = 25)。D，队列B的PFS通过PD-1+ CD8+ TCR多样性进行分层 (n = 15)。E，队列A的OS通过PD-1+ CD8+ TCR库多样性进行分层 (n = 25)。F，队列B的OS通过PD-1+ CD8+ TCR库多样性进行分层(n = 15)。G, TCR多样性对判断PD-1或PD- L1抑制剂的临床反应(DC vs PD)的敏感性和特异性(n = 40;DC, n = 23, PD, n = 17)

然而，Hogan等人在一项研究发现TCR库多样性与anti-PD-1治疗结果存在负相关（图6）^[8]。在该研究中，作者采用multi-N-plex PCR技术测试了接受anti-CTLA4 (n = 42) 或anti-PD1 (n = 38)治疗的黑色素瘤患者在治疗前PBMC的TCR库组合多样性均匀度（DE50，其数值越低，代表TCR克隆越多，多样性越少）。在多变量回归模型中评估治疗结果、临床变量和DE50之间的相关性，并通过Fisher精确检验进行验证。结果显示，低DE50数值预示着患者anti-PD-1治疗有良好反应和更长的PFS，但是对于anti-CTLA-4治疗预示着较差的临床获益。不同研究结果的差异表明，需要更深入的研究，以助于更好地了解其他因素对TCR库变化的影响。

图6  治疗前TCR多样性的均匀度^[8]。A，散点图显示对anti-CTLA-4治疗有反应或无反应患者的基线DE50。N = 42。虚线，20.03%。B，散点图显示对anti-PD-1治疗有反应或无反应患者的基线DE50水平。N = 38。虚线，20.4%。用Fisher精确检验计算P值

PART 03

尽管缺乏对TCR库如何影响癌症发展的了解，但目前已有明确的证据表明，TCR库在作为预测肿瘤进展或预测ICIs治疗效果的生物标志物方面具有巨大的潜力。

熙宁|精翰NGS实验室应用基于多重PCR建库的免疫组库检测方法特异性地扩增TCR/Ig受体链编码基因（TRB、TRD、TRG，以及IgH、IgL、IgK），检测T/B细胞受体基因的克隆性重排，在时序样本检测中，通过检测患者体内TCR谱系的变化来评估治疗效果以及跟踪疾病进展或复发。本检测方法已经经过了完善的性能验证，可以供申办方直接使用。

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参考文献：

[1] Aran A, Garrigós L, Curigliano G, Cortés J, Martí M. Evaluation of the TCR Repertoire as a Predictive and Prognostic Biomarker in Cancer: Diversity or Clonality? Cancers (Basel). 2022 Mar 31;14(7):1771. doi: 10.3390/cancers14071771. PMID: 35406543; PMCID: PMC8996954.

[2] Porciello N, Franzese O, D'Ambrosio L, Palermo B, Nisticò P. T-cell repertoire diversity: friend or foe for protective antitumor response? J Exp Clin Cancer Res. 2022 Dec 22;41(1):356. doi: 10.1186/s13046-022-02566-0. PMID: 36550555; PMCID: PMC9773533.

[3] Postow MA, Manuel M, Wong P, Yuan J, Dong Z, Liu C, Perez S, Tanneau I, Noel M, Courtier A, Pasqual N, Wolchok JD. Peripheral T cell receptor diversity is associated with clinical outcomes following ipilimumab treatment in metastatic melanoma. J Immunother Cancer. 2015 Jun 16;3:23. doi: 10.1186/s40425-015-0070-4. PMID: 26085931; PMCID: PMC4469400.

[4] Joshi K, Milighetti M, Chain BM. Application of T cell receptor (TCR) repertoire analysis for the advancement of cancer immunotherapy. Curr Opin Immunol. 2022 Feb;74:1-8. doi: 10.1016/j.coi.2021.07.006. Epub 2021 Aug 25. PMID: 34454284.

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[6] Robert L, Tsoi J, Wang X, Emerson R, Homet B, Chodon T, Mok S, Huang RR, Cochran AJ, Comin-Anduix B, Koya RC, Graeber TG, Robins H, Ribas A. CTLA4 blockade broadens the peripheral T-cell receptor repertoire. Clin Cancer Res. 2014 May 1;20(9):2424-32. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-13-2648. Epub 2014 Feb 28. Erratum in: Clin Cancer Res. 2015 Jul 15;21(14):3359. PMID: 24583799; PMCID: PMC4008652.

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