PART 01

从结构上来说，ADC是由单克隆抗体、连接子和小分子药物构成的多结构域分子，通过ADC分子的抗体部位特异地结合到目标细胞表面的靶抗原，介导内化作用后进入细胞，再通过细胞内环境和溶酶体的作用释放出小分子药物发挥作用。与单独使用抗体或小分子药物相比，ADC 兼具了小分子与抗体药物的双重优势。

理想的ADC药物能在循环系统中稳定存在并能准确到达靶标部位，最终在靶标位置释放载荷。从靶点上来说，理想的靶点需要满足两个条件，一个是仅在靶标细胞上表达或者主要在靶标细胞上表达，第二个是在抗体结合后可以进行内化。传统的靶点是在肿瘤细胞上高表达的一些靶点，比如HER2、EGFR，目前也有一些较新的靶向肿瘤微环境的ADC靶点。从抗体上来说，为了更好的将ADC导向靶标细胞，抗体需要考虑其亲和力、靶点结合后内吞入细胞的能力、免疫原性以及半衰期等。目前抗体端除了使用人源化的单抗以外，减少分子量以增加穿透性的抗体片段、增加靶向效率的双表位或者双靶点的双抗也出现在不少ADC中。连接子也是非常重要的部分，直接决定了ADC的稳定性以及在肿瘤细胞中释放毒素的效率，包括可裂解和不可裂解两种类型，不可裂解的连接子在循环系统中更稳定，脱靶毒性较低；可裂解的连接子在小分子药物释放后可以发挥旁观者效应，增加效果。小分子药物主要是针对肿瘤适应症的毒素，例如微管蛋白抑制剂、DNA损伤剂，或者是一些针对自身免疫适应症的激素类调节分子，目前也有一些ADC药物同时连接两种不同的小分子药物协同发挥药效。

ADC药物发展至今共经历了三代技术的变革，在稳定性、DAR（小分子药物和抗体的结合比）值均一性、CMC特性、抗肿瘤活性上都在不断改善，治疗窗口也在不断扩大。尤其是第三代的ADC，由于定点偶联技术的发展，在很大程度上改进了DAR值均一性的问题，改善了ADC药物的药代动力学特性。

PART 02

本质上来说，ADC药物是一个不均一的混合物。不同的DAR值，同样DAR值不同的偶联位点，都可能产生不同的分子。在进入体内以后，一方面ADC分子可能会因为体内的降解而产生相应的变化，另一方面不同DAR值的ADC分子可能会有不同的清除率，所以随着给药时间的推移，不同采样点上ADC的DAR值分布和开始给药的ADC药物可能会有很大的不同，尤其是在比较靠后的时间点。

随着ADC分子在体内的代谢变化，最终会形成不同的检测物形式，主要是不同DAR值的完整的ADC分子、没有连接小分子药物的裸抗、游离的小分子药物及其代谢物。那在临床生物分析检测时，重点需要关注检测哪些形式呢？可以先看一下已上市的ADC药物的相关信息。

表1  已上市ADC药物临床PK检测形式总结

从上表的总结可以看出，在目前全球上市的15款ADC药物的临床PK检测上，绝大部分检测的是总抗体（PK-TAb）、ADC（PK-ADC）和游离小分子药物（PK-Payload）这三项。在检测方法上，通常使用LBA方法检测总抗体和ADC，少量上市药物使用LC-MS进行检测，游离小分子药物均使用LC-MS方法检测。

PART 03

从ADC的代谢特征上来看，目前ADC药物总体而言表现的是类似抗体的特征，比如较低的清除率、较长的半衰期、低分布容积、非线性分布和消除等。

对于反映ADC药物PK特征的总抗体和ADC的检测，目前LBA是最常用的检测方式，从方法设计上来说，对于总抗体，可以使用一对试剂对来分别作为捕获和检测试剂，这里的试剂可以考虑使用特异性的抗ADC抗体端的抗体、靶点蛋白、通用型的抗IgG抗体。对于ADC的检测，通常使用抗小分子药物的抗体作为捕获试剂，再使用抗ADC抗体端的抗体、靶点蛋白或者通用型的抗IgG抗体作为检测试剂进行试剂配对组合。

图1  ADC药物-TAb & ADC 方法设计

由于ADC药物的PK需要检测TAb和ADC两种不同的形式，为了最大程度的保证两种不同形式检测结果的可比性，需要在方法开发中重点考虑DAR值敏感性和靶点干扰对检测的影响， 并在开发中最大程度保证两种方法的一致性。

ADC药物在进入体内以后，会有一系列的代谢转化。一方面ADC分子中的毒素可能会在循环系统脱落或部分脱落，另一方面不同DAR值的ADC分子可能会有不同的清除率，通常DAR值更大的分子清除率更快。所以从ADC分子的变化来说，随着时间的推移，分析物本身的DAR值分布总体而言会有降低的趋势。在分析方法开发时，使用不同DAR值标准品进行测试，选择DAR值不敏感的分析方法就是一个保证样品结果可比性的关键点。

例如上表中的例子，在该例子中，ADC的平均DAR值是4，从不同配对试剂的结果来看，对于总抗体的测试数据，其试剂配对1在低DAR值标准品及裸抗检测时，测定结果明显偏低，试剂配对2受DAR值影响较小；对于ADC的方法而言，其试剂配对1受DAR值影响较小，但试剂配对2在检测低DAR值标准品时明显结果偏低。在这个例子中，如果我们在总抗体和ADC的检测上，都选择其相应的试剂配对1，在实际的样品检测中，很可能会出现ADC浓度大于总抗体的情况，因为总抗体检测结果在DAR值变低后是偏低的。另外，如果我们在总抗体和ADC的检测上，都选择其相应的试剂配对2，结果很可能会出现ADC浓度明显低于总抗体的情况，看上去像是ADC分子的毒素有很多全部脱落了，但其实和方法学也有不小的关系。

从上面的讨论中，我们可以看出，ADC临床检测中出现的有些不合逻辑的问题，是可以在方法学中找到原因的，我们也可以通过前期方法学更细致的设计和测试，选择最优的方法形式以免在样品检测中出现问题。就如上面这个例子，最终正确的选择显然是用总抗体的试剂配对2进行总抗体的检测，ADC的试剂配对1进行ADC的检测，这样才能保证方法学检测不同DAR值ADC产物的一致性。

ADC药物是靶向细胞上的靶点，靶点通常在循环系统中浓度并不是很高，因此靶点干扰的问题经常容易被忽视。但在实际的项目中，一方面部分靶点在循环系统中的浓度并不低，例如BCMA，浓度在几百ng/mL；又例如HER2，在部分高表达患者中，循环系统中能到达μg/mL水平；另一方面，很多靶点在给药后循环系统中的总浓度会增加，这些都会增加靶点对方法的影响，尤其是对一些样品浓度低的采样点，如果分析方法在总抗体和ADC方法的靶点耐受上差异很大，很可能也会造成检测结果的不一致。

总体而言，对于靶点干扰的问题，需要我们在方法设计时关注总抗体和ADC方法检测的药物形式是否有差别，也就是我们在单抗检测中的total和free的问题。那另外就是在开发阶段，需要进行靶点干扰的测试，选择不受靶点预期浓度干扰的方法形式，或者选择靶点对总抗体和ADC干扰程度近似的方法形式。

对于总抗体和ADC的检测，在方法层面上尽可能保证一致性，也能更好的保证样品在检测上的一致性。例如，除包被试剂不同外，尽可能使用相同的缓冲液和检测试剂；方法参数（定量范围、MRD等）及操作尽可能一致。在定量范围一致的情况下，推荐使用同一批标准曲线和质控样品进行总抗体和ADC的检测，以减少配制带来的差异。

PART 04

熙宁生物|精翰生物在ADC药物的检测上积累了丰富的经验，涵盖ADC药物的热门靶点EGFR、HER2、FRα、Trop2、Nectin-4、B7-H3等等，目前有20多种ADC药物正在熙宁|精翰进行检测分析，欢迎感兴趣的朋友在后台留言咨询。