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近些年肿瘤免疫疗法迅速发展，诸如CART、TIL、双抗等高效的免疫疗法在临床试验中已展现出明显的肿瘤杀伤和临床有效性，其中一些药物已经获批上市，许多患者因此受益，生命得到延续。在这些药物研究的过程中，细胞因子释放综合征作为一种常见的免疫治疗不良反应事件受到广泛关注。
细胞因子属于小分子蛋白质，对细胞间的相互作用及信号传导有影响。细胞因子包括淋巴因子、单核细胞因子、趋化因子、白介素等，既有促炎细胞因子也有抗炎细胞因子。有些细胞因子在适量情况下可以起到抑制肿瘤的作用，例如NK细胞受刺激后通过穿孔素/颗粒酶通路或凋亡诱导配体溶解肿瘤，分泌干扰素-γ，抑制肿瘤细胞增殖、增强肿瘤细胞凋亡、调节抗原呈递，抑制血管生成。免疫细胞在抵抗外来入侵或清除异常时会释放大量促炎因子（如干扰素、白细胞介素、肿瘤坏死因子等）。当免疫系统获得胜利后，便会减少细胞因子的释放，维持机体稳态。然而，在进行免疫治疗时，如果免疫系统过度激活，便会产生过多的细胞因子，引发细胞因子风暴。细胞因子风暴又称为细胞因子释放综合征（CRS），是一种常见的免疫治疗并发症，尽管这种不良反应发生率比较低，但CRS一旦发生就会引发全身的炎症反应，严重时可能危及生命。
目前临床上最常见的细胞因子风暴检测指标包括IL-6、TNF-α、IFN-γ等，可以通过多因子组合进行检测以节省样本体积和检测成本，提高检测效率。
细胞因子属于生物标志物的范畴，由于生物标志物的复杂性，目前还没有明确的方法验证指南文件。2018年版FDA发布的BMV指南中提到：当生物标志物数据用于支持监管决策时，例如用于药物安全性和/或有效性的重要决定，或用于支持药物标签中的剂量说明时，其分析方法应得到充分验证。但同时，对于生物标志物的方法学做到何种程度，建议基于fit for purpose原则来确定。例如：对于用于支持监管决策的指标，应进行完整验证，对于探索性指标，进行部分验证或方法测试。
方法的完整验证参考PK的验证要求，完整验证包括至少准确度和精密度、平行性、基质效应、稀释线性和稳定性。
由于大多数生物标志物在基质中有一定的内源性水平，标准曲线通常配制在缓冲液或替代基质中，如果可以筛选到足够的几乎不含内源性生物标志物的基质，也可以采取和PK相同的方式进行方法学。
质控样品应使用基质来制备，优先选择合适内源性水平的基质作为各浓度水平的质控样品（ULOQ、HQC、MQC、LQC、LLOQ），如果没有合适的内源性基质，可在基质中加入适当浓度的标准品来制备。
对于多因子检测方法，由于同一个体基质中不同因子的浓度水平可能会有较大差异，对于难以协调的因子，可以单独设置其质控样品。
准确度和精密度
准确度和精密度的考察将通过6个分析批进行，每个分析批包含一套标准曲线和三套五个水平的质控样品，用所有质控样品的浓度数据计算批内和批间的准确度和精密度。
各浓度水平的质控样品浓度可以在方法验证前采用至少三个分析批测定后取平均值来确定，也可以在方法验证期间的准确度和精密度实验中确定。
平行性
由于生物标志物所使用的重组蛋白标准品是一种替代参照品，和内源性待测物并不完全一样，所以生物标志物的平行性考察尤为重要。平行性考察可以告诉我们替代标准品和内源性待测物在检测方法中的表现是否一致。通过将纯基质的样品使用和配制标准曲线样品相同的稀释液进行序列稀释，不同稀释度的样品乘以稀释倍数后浓度之间的%CV在30%以内，则平行性考察通过。
选择性
选择性，也可以称为基质效应，可通过在个体基质中分别加入高浓度和低浓度水平的标准品进行考察，需要注意在计算回收率时要将内源性水平考虑进去。另一种方式是加入一定浓度的标准品后进行序列稀释，以第一浓度点作为参考值计算后续稀释样品点的偏差，也就是说当不同稀释度的样品点在乘以稀释倍数后得到的浓度值接近时，就说明含不同比例的基质对检测没有影响，就可以认为无基质效应。
稀释线性
如果预期将来的样品会产生高于定量上限的浓度，则需要证明稀释线性。稀释线性的考查方式和平行性类似，区别在于稀释线性需要根据将来样品的预期能达到的最高浓度配制加标样品，使用该高浓度加标样品作为起始样品进行稀释后考察。在样品预计的稀释倍数不高于平行性中评估的稀释倍数时，也可以基于平行性测试对稀释线性进行评估。
稳定性
稳定性包含室温、2-8℃、冻融及长期稳定性。不同于PK方法，生物标志物的稳定性以基线测定浓度作为参考值进行处理后样品的评估。
熙宁生物|精翰生物积累了大量的细胞因子检测经验，对于常见的细胞因子已开发相应的自主产权方法学，如7因子方法学(IL-2、LI-4、IL-6、IL-8、IL-10、IFNγ、TNF-α)，10因子方法学等，可用于细胞因子释放及临床样本的检测，为申办方节省方法学建立的时间和费用成本。同时生物标志物平台目前已具备全面覆盖不同样本的检测能力，从组织、细胞、蛋白、基因分子各个维度都可以提供相应的检测方案，欢迎各位交流咨询。
已有生物标志物自主产权方法(部分)
