前言

地球上病毒数不胜数，目前已被人类鉴定出的病毒超过5000种。自人类起源起，人类与病毒展开了激烈的交锋。虽然人类医学取得长足的进步，但面对病毒，往往还是没有特效药，一般通过疫苗免疫，或者通过药物抑制病毒复制，从而减轻症状。近年来，中和抗体类药物逐渐展现了在病毒治疗中的潜力，包括HIV广谱中和抗体，再到再生元公司开发的全球首款抗埃博拉病毒药中和抗体鸡尾酒疗法Inmazeb，以及目前研究火热的新冠中和抗体药物。

中和抗体（Neutralizing antibody），是由适应性免疫应答细胞分泌的一种可溶性蛋白，其作用机理如图1所示，此类药物大多靶向病毒受体结合域，通过阻断病毒与人体正常细胞之间的相互作用来防止病毒感染人体细胞。药物上市前需要进行非临床和临床试验，对药物安全性和有效性进行评估。中和抗体药物属于大分子蛋白类，检测药物浓度主要是配体结合法（LBA）。随着质谱技术的不断发展和广泛应用，本文介绍基于LC-MS/MS检测中和抗体药物浓度的方法。

图1 

质谱检测蛋白类药物一般主要分为变性，还原，烷基化，酶解等步骤，如图2所示。根据不同待测物的性质，灵敏度要求和干扰情况，还可以增加其他的前处理方式，比如在样品变性和（或）上样前进行纯化，来提高灵敏度和降低干扰的影响。在针对蛋白质前处理和检测进行详细的介绍之前，我们先对比一下LCMS与LBA在应用于抗体检测的区别。如图3所示，首先是灵敏度，如果单纯从PK分析角度考虑，LCMS方法同样可以满足常规抗体检测的需求；其次是特异性，质谱的特点的就是专属性强，它可以通过选择特异性肽段来进行定量，所以这种方法相较传统LBA方法能够更好的避免干扰的影响；第三是关键试剂，质谱方法比LBA方法对于关键试剂的依赖程度低；第四个是方法开发时间，由于质谱检测可能不需要特殊的关键试剂，且方法开发流程相对简单，在方法开发耗时上有一定优势；最后一个是线性范围，质谱检测线性范围一般是500~1000倍，相比LBA要高的多。除此之外还有质谱可以同时检测多个待测物，检测效率高等诸多特点。下面我们详细介绍一下抗体前处理方法。 

图2

图3 

样品纯化

如果在方法开发阶段受到灵敏度和基质干扰的影响，可以选择样品纯化，但这也会增加实验成本和操作步骤。一般样品纯化的方式主要有Protein A/G磁珠或者链酶亲和捕获。Protein A/G相对比较简单，可以直接使用磁珠进行非特异性抓取，这种方法虽然操作比较简单，但干扰相对较大。图4介绍的是链酶亲和捕获的纯化方式，首先Biotin标记的捕获试剂与抗体结合，然后再与链酶亲和素磁珠结合从而达到纯化目的，这种方式特异性强，样品纯化程度高，干扰小。

图4

变性

抗体属于蛋白，拥有多重空间折叠结构，因此样品纯化完成后，需要进行蛋白变性，打开空间结构。常见蛋白变性的主要方式可分为，1）高温，例如95℃；2）有机试剂，例如甲醇；3）强酸，例如高氯酸、三氯乙酸；4）蛋白变性剂，例如RapiGest SF，盐酸胍，尿素。在这些方法中也需要考虑一些问题，比如加入蛋白变性剂后对于后续酶解使用的蛋白酶活性可能产生很大的影响，从而影响酶解效率。因此可能需要脱盐处理，或者进行稀释降低对酶活性影响。

还原、烷基化

由于抗体通过二硫键的形式连接，因此打开二硫键能更加彻底的分解抗体，一般使用到像DTT或TCEP这样的还原剂。DTT需要在碱性条件下才能发挥作用，稳定性较差，而TCEP作为还原剂不管是酸性或碱性条件下都可以发挥还原作用，同时也具有较高的稳定性。打开二硫键后裸露巯基还是会再次形成二硫键，因此需要保护巯基。通过加入的碘乙酰胺与巯基发生烷基化，从而避免二硫键的形成，还原、烷基化过程见图5。这一步骤需要注意的是处理条件，像DTT需要在碱性条件下发挥作用；由于碘乙酰胺的稳定性问题，需要在避光条件下反应。此外还需要关注试剂的储存条件和有效期等等。

图5

酶解

酶解反应决定了质谱检测的检测物，最常使用胰酶作为酶解工具，它能够精准剪切赖氨酸和精氨酸，产生比较固定的肽段。此外还可使用木瓜蛋白酶，这是一个广泛特异性酶，除了能够剪切赖氨酸精氨酸，还能剪切甘氨酸和瓜氨酸。酶解反应这一步主要需要考虑反应条件和时间，比如最适宜的pH和温度，一般我们常使用37℃反应2小时或过夜反应。

酶解后产生许多多肽碎片，如何去确定是抗体特异性肽段。通常会使用到一些数据库，例如Peptide MS Fingerprinter，Skyline，MRMAid。可以通过软件设定酶解酶，以确定产生一级和二级离子碎片。选择肽段主要需要考虑是能够满足灵敏度检测要求，特异性高干扰小，还有多肽本身稳定性，同时能产生稳定的信号响应。

方法学验证

对于方法学验证，一般小分子化药遵循各国法规单位发布的生物分析指导原则，但是针对抗体LC-MS检测方法，暂时没有相关的指导原则，目前可参考的主要是“2021 White Paper on Recent Issues in Bioanalysis”，其验证项接受标准可参考配体结合实验，从我们实验室做的结果来看，是完全可以满足小分子化药生物分析的接受标准。在验证内容方面，除了常规精密度和准确度，选择性，稳定性外，我们还需要重点关注回收率/酶解效率，基质效应，如果使用磁珠纯化，还需要考察捕获效率，捕获容量等。

案例讨论

根据抗体氨基酸序列，通过软件筛选出可变区域的数个特异性肽段，抗体前处理后通过质谱去确定特异性肽段的子母离子，然后优化液相质谱条件。由于抗体酶解后会产出很多肽段，可能存在较大干扰，因此特异性肽段筛选是质谱检测中最关键的步骤。因此，我们通过制备空白样品，进一步筛选出一个不存在明显干扰的特异性肽段。为了减少实验操作流程和成本，在满足灵敏度要求的情况下，该实验没有采用磁珠纯化和处理后固相萃取纯化的操作步骤。通过优化前处理步骤以及液相质谱条件就能达到非常好的重现性和灵敏度，同时不存在明显的基质干扰，对于内标选择，本实验定制了特异性肽段同位素内标。下面总结了相关实验数据。

线性、精密度和准确度

本实验线性范围为100~50000 ng/mL，代表性标准曲线见图6，相关系数r=0.9998。表明线性关系良好。

通过考察3个分析批，5个浓度质控样品，用以评估该方法的精密度和准确度。结果显示批内精密度和准确度（含LLOQ QC的所有浓度质控）准确度偏差范围为-7.6~11.1%，%CV最大值为5.8%；批间精密度和准确度（含LLOQ QC的所有浓度质控）准确度偏差范围为-3.2~5.4%，%CV最大值为3.3%。 

图6

选择性

选择性考察不同来源的空白基质以及高脂，溶血基质，评估空白基质对待测物和内标的干扰。同时考察了内标对待测物的干扰。图7（I）为空白基质图谱，图7（II）为零浓度样品图谱；图7（III）为定量下限和内标图谱； 

图7

基质效应

在方法开发中发现，由于方法的特殊性，通过比较含有基质样品与纯溶液样品差异来考察基质效应差异很大，可能由于纯溶液中抗体药物非特异性吸附和酶解效率差异。因此，本实验基质效应通过考察了不同来源的空白基质，在三个浓度下进行，比较不同基质间是否存在基质效应。在三个浓度下，不同来源基质的峰面积比%CV分别为2.6%，1.8%，2.1%。

讨论

本实验考察了线性，精密度，准确度，选择性，高脂/溶血基质效应，稀释测试，室温稳定性以及长期储存稳定性，结果均符合预期的接受标准，表明该方法可以用于后续临床样品的检测。值得注意的是，在实验过程中对于试剂的选择，反应条件和时间，耗材的选择，尽量保持一致，需要关注配制试剂的稳定性和储存条件，否则可能会导致方法重现性不佳；此外，由于样品前处理操作较为繁琐，需严格按照方法操作，避免发生污染，对操作人员的实验素质提出了一定的要求。

结束语

熙宁生物质谱平台能够提供符合NMPA/FDA/OECD/EMA的各项生物样品分析服务，支持小分子药物、多肽、寡核苷酸、PROTAC、ADC以及大分子抗体等药物的方法开发、验证和样品检测。平台配备了含多套高端液质联用系统和Watson LIMS在内的生物分析系统和软件系统，各种先进辅助设备，不仅可以满足各类型实验的检测需求，还极大提高了实验效率和质量。 我们能够更快、更好为客户提供专业的技术服务，更高效地帮助客户进行药品研发。