一、体液免疫原性中和抗体检测方法构架

体液免疫包含结合抗体和中和抗体检测，相对于结合抗体检测，中和抗体更加具备生理学意义，由于中和抗体检测涉及到病毒，细胞等关键事件其方法学开发，验证和数据解读也会变得比较复杂。

mRNA感染性疫苗，AAV Based药物和溶瘤病毒，均可采用中和抗体检测方法进行体液免疫原性评估，且有着类似的技术路径。临床生物分析实践过程中，通常会采用表达CMV-Luc的假病毒用来模拟基因治疗药物的病毒载体或者真实病毒，假病毒和被模拟替代的病毒有类似的衣壳蛋白或者关键侵染细胞的蛋白。将假病毒和待测血清样品孵育，加入靶细胞中，如果假病毒能够感染细胞，将会表达luciferase，加入检测试剂后会出现信号值，血清未起到阻断假病毒感染细胞的生理学作用，血清中没有中和抗体。如果加入检测试剂后信号值降低，则血清中存在中和抗体，血清中的中和抗体阻断了假病毒感染细胞，通常人血清中中和抗体的强度和信号值呈负相关，通过血清样品检测信号值的转化计算，可以获得血清样品中抗基因治疗药物的中和抗体滴度值。检测原理和检测体系如图1所示：

图1.  基因治疗产品中和抗体检测原理和体系

二、体液免疫原性中和抗体检测方法难点解析

基于基因治疗药物的临床生物分析实践，中和抗体检测在方法学开发和验证过程中有以下难点和要点。

讨论：

由于基因治疗药物的病毒载体通常存在预存抗体的情况，阈值并非通过试验测定，阈值通常定义为阴性对照的一半，样品分析通常需要进行梯度稀释汇报滴度值，因此整个检测体系的构建和数据结果的解释相对常规免疫原性检测会更复杂，需要有健全的方法学验证和数据汇报体系。

临床样品中的血清通常含有促进病毒（如AAV2/8/9）感染细胞的作用，如图2所示，在人血清体系中比在培养基体系，AAV2的感染效率提高了5-10倍。在检测体系中人血清的基质成分会导致信号的增加，人血清中的中和抗体会导致信号的减少，检测方法中存在两个拮抗的变量可能会导致检测结果失真，特别是样品进行梯度稀释时，人血清的比例会逐渐减少，促进作用逐渐减弱血清梯度稀释造成的不均一的基质影响，会导致检测结果的失真以及数据解读困难。由于预存抗体的存在，常规PK方法中使用一定比例人血清稀释液进行样品稀释的手段也会遇到问题，需要有较为精妙的设计来排除人血清的干扰。

图2. 人血清极大提高了AAV2的转染效率

三、体液免疫原性中和抗体检测方法要点解析

1.

中和抗体检测滴度值通常会作为AAV Based疗法病人入组筛查的标准，如图3所示，展现了部分上市基因治疗产品和国内基因治疗产品的入排标准。就中和抗体的方法学而言，中和抗体分析方法受到试验体系如加入的细胞量，病毒量，MOI，病毒感染细胞时间不一样的影响，方法的灵敏度会不一样，通常不同试验室方法的可比性和一致性较差。可能会出现同一样品在不同实验室中进行检测，得到较大差异滴度值的情形。中和抗体检测滴度值作为入组筛选标准需要谨慎进行调研考察，需基于方法学的检测数据进行评估选择。

图3. 部分AAV药物体液免疫抗体滴度入组

筛查标准

2.

应选择合适的中和抗体滴度值作为入组排除标准。中和抗体滴度值标准选择过低，可能使药物上市后获益人群较少，中和抗体滴度值标准选择过高，中和抗体可能会影响到药物在人体的有效性和安全性，药物临床的成功率会受到影响。根据文献记载，不同地域人群中AAV预存抗体的比例和强度均会不同，同时不同血清型的AAV其预存抗体的比例和强度也会不一样，针对不同血清型的AAV载体需要基于当前方法学中健康人群的AAV预存抗体的比例和强度进行合适的稀释倍数设计和样品分析，以及基于当地健康人群体中的中和抗体滴度来选择合适的中和抗体滴度值作为入组排除标准。熙宁实验室对同一批健康人血清进行了AAV2和AAV8的中和抗体滴度检测，部分检测结果如图4。值得注意的是在AAV8滴度值小于5的健康个体中，其AAV2的滴度值均小于500，暗示着机体对不同血清型AAV之间可能存在交叉免疫的情况出现。

图4. AAV预存抗体强度和健康群体比例

四、总结

中和抗体检测是体液免疫检测的重要一环，对于以病毒为载体的基因治疗药物，特别是以AAV为载体，机体预存的中和抗体是影响基因治疗药物有效性和安全性的关键因素。在病人入组筛选时，中和抗体滴度作为入组筛查的标准，甚至会影响到药物的临床药效评估，以及未来上市后的市场范围。

以假病毒感染细胞作为检测模型的中和抗体检测方法在临床检测过程中，血清的基质干扰是方法学难点，血清基质的存在会促进病毒感染细胞，同时血清中的中和抗体会抑制病毒感染细胞，在一个检测方法中同时存在两个拮抗的变量时，检测结果的准确性和一致性是很难保证的，熙宁生物基于巧妙的试验设计，将个体血清对检测体系的干扰进行了排除，使检测方法能够单一变量反应中和抗体滴度的强弱。经熙宁生物进行了充分验证的方法能够真实准确的进行血清样品的中和抗体滴度检测。

同时熙宁生物有较为广阔的人健康群体基质库，对不同血清型AAV在人群中中和抗体滴度强度和分布比例有极为清晰的认知，能够和客户共同协作进行病人入组中和抗体滴度阈值确认的工作，助力AAV基因治疗药物的临床研发。

基因治疗作为热门的新兴疗法，近些年发展迅速。同时，基因治疗药物研发需求多样化、技术复杂度高的特点，也对检测分析带来巨大挑战。熙宁生物搭建了基于基因治疗药物检测需求的基因检测平台、细胞/病毒检测平台、流式检测平台和免疫检测平台等，能够满足研发项目在不同阶段的在生物分析需求。团队专注于GCT领域，积累了丰富的实战经验和专业的技术服务能力，通过qPCR/ddPCR技术、细胞法中和抗体检测技术、ELISPOT细胞免疫原性检测技术、流式检测技术、ELISA/MSD检测技术等多平台技术互联，打通技术隔阂，真正实现“一个临床/项目，一个生物分析实验室，一个技术项目团队”的服务方式，为基因治疗产品生物分析提供完整解决方案。