声明：本文中所涉及的所有信息均来自于公开信息，不涉及客户保密信息。

作为治疗胃癌、食管癌和胰腺癌等消化道肿瘤的明星靶点，CLDN18.2(claudin18.2)吸引了众多制药企业竞相布局，成为继PD1/PD-L1之后另一个抗肿瘤生物药开发的风口。这里，我们通过总结CLDN18.2的蛋白结构，组织表达及药物临床相关信息，尤其是免疫组化检测的cutoff值设定，希望能为广大同行带来一些启发和帮助。

CLDN18基因与蛋白表达

CLDN18 是CLDN家族的成员，在细胞间紧密连接中起主要作用，编码基因长达35Kb，位于3号染色体3q21-23区域。该基因以可变剪接的形式转录出两种mRNA，进而翻译出两种蛋白（图1）。CLDN18.1 和CLDN18.2高度同源，氨基酸序列相似度约为92%，其差异仅存在N端第一个外显子，CLDN18.1使用的是1a外显子，CLDN18.2用的是1b外显子1。然而，可用于药物开发和诊断检测的第一胞外环（ECL1）的55个氨基酸中仅存在8处差异2，相似度非常高。同时，CLDN18.2作为膜蛋白，胞外区较短，这新药开发和诊断抗体开发工作带来了较大的挑战。

图1 CLDN18.1（上）与CLDN18.2（下）的可变剪切

CLDN18蛋白的表达呈现高度的组织特异性。正常组织中，Claudin18.1仅表达于肺部，CLDN18.2仅在胃粘膜已分化的上皮细胞表达，其他组织均无表达2（图2）；该特征为CLDN18.2成为潜在的抗肿瘤靶点奠定了非常好的基础，有助于降低药物的非肿瘤靶向的毒性（on-target off-tumor toxicities）。

图2 Claudin18.1(CLDN18.1)与CLDN18.2(CLDN18.2)在正常组织中的分布（mRNA水平）

总之，在正常生理状态下CLDN18.2仅在埋藏于胃粘膜上已分化的上皮细胞中表达，正常组织中的单抗基本上接触不到。然而，当恶性肿瘤发生后，原本的紧密连接破坏，使肿瘤细胞表面的CLDN18.2表位暴露出来。当组织癌变后， CLDN18.1的表达未见明显变化，CLDN18.2则出现异常激活，高度选择性表达于胃癌、食管癌、胰腺癌、肺癌等。据文献披露，CLDN18.2表达发现于38%~87%胃癌3,4,5,6,7、20%~59%胰腺癌5、18%食管癌8和3%非小细胞肺癌9。对于晚期转移性胃癌，HER2阳性率不足20%4。相对广泛的肿瘤特异性膜表达，使之成为较为理想的抗肿瘤药物靶点和潜在的伴随诊断开发生物标志物。当然，药物开发过程中为了降低毒副作用，有效规避与CLDN18.1的交叉反应也是必不可少的。对于诊断抗体而言，特异性结合 CLDN18.2而不与CLDN18.1结合是精准地指导患者筛选的基本要求。

CLDN18.2药物临床进展及诊断cutoff值

目前，全球约有60款在研CLDN18.2药物，除单克隆抗体外，嵌合抗原受体T细胞治疗（CAR-T）、双特异性抗体，抗体偶联药物（ADC）和mRNA疗法等也成为CLDN18.2新的治疗方向。

单克隆抗体相关药物

单抗领域是CLDN18.2药物进展最快的领域。相关免疫组化检测的信息也是最多。进展最快的是安斯泰来的Zolbetuximab。在该药的临床中，影响比较大的主要是Mono研究和FAST研究。研究人员为确定目标人群的CLDN18.2表达的cutoff值，进行了不懈探索，可以为后来者提供一定的参考。

Mono研究

在Mono研究(NCT01197885）中，经过筛选，从268名患者中选择了54 位≥50% 肿瘤细胞中等或强表达CLDN18.2的患者入组。结果显示，总体客观缓解率(ORR)为 9%，达到SD（Stable disease） 的患者为 14%。然而，在≥70% 肿瘤细胞中等或强表达 CLDN18.2 的患者中，ORR值更高， 为14%，SD的比例也上升到17%。由此可见，CLDN18.2单抗对于CLDN18.2高表达人群显示更好的疗效（图3）10。该试验中使用的IHC抗体是来自Zymed的抗CLDN18.2的兔多抗，结果的可重复性较差。同时，鉴于该研究只是一个单臂试验，入组人数也有限，且ORR值并不高，后续需要更多的临床研究和改进。不可否认的是Mono研究初步确定了Zolbetuximab后续临床试验的cutoff值为70%。

图3 Mono研究中肿瘤体积变化。A：CLDN18.2染色细胞比例<70%，B：CLDN18.2染色细胞比例≥70%

FAST研究

2021年2月，Ann Oncol发表Ⅱb期临床试验FAST研究（NCT01630083）的临床试验数据，为外界披露了单克隆抗体Zolbetuximab进一步的数据。考虑到MONO研究单药治疗相对较低的反应率，FAST研究采用了Zolbetuximab联合化疗(EOX)的治疗方案。同时，为了进一步验证，CLDN18.2 的cutoff值，选择了≥40% 肿瘤细胞中等或强表达 CLDN18.2为入组条件。检测方法使用的是CLAUDETECT™18.2 immunohistochemistry assay [Ganymed, Germany]，克隆号为43-14A。该抗体实质上是一个既能识别CLDN18.1也能识别CLDN18.2的抗体，特异性较低。结果显示，Zolbetuximab 联合化疗相对与单独化疗显著改善了mPFS（7.5 vs 5.3 个月）和mOS（13.0 vs 8.3个月）。在探索性分析的过程中，高表达组，即≥70%肿瘤细胞CLDN18.2阳性患者的mPFS长达9个月，mOS更是达到了16.5个月，甚至优于曲妥珠联合化疗的13.8个月的mOS，而40-69%肿瘤细胞CLDN18.2阳性患者的mPFS和mOS在Zolbetuximab 联合化疗的情况下与单独化疗没有显著性差异（图4）。该结果进一步确认了70%的cutoff值6。

图4 FAST研究中PFS和OS变化  

总体PFS和OS（A,D），≥70%肿瘤细胞CLDN18.2阳性PFS和OS（B,E）和40-69%肿瘤细胞CLDN18.2阳性PFS和OS（C,F）

SPOTLIGHT研究和GLOW研究

基于前期研究，基本明确了以70%肿瘤染色比例作为cutoff值。然而，在III期试验SPOTLIGHT(NCT03504397)和GLOW（NCT03653507）中，研究人员将Cutoff值改成了75%（检测抗体克隆号仍为43-14A）。主要是因为IHC方法从原来的手工方法改为Ventana自动化平台方法。据文献提示，自动化平台中75%肿瘤细胞阳性等效于原手工方法的70%阳性11。自动化平台方法的使用使得检测过程更加稳定，结果判读更加可靠。至此，基本确认了基于Ventana平台的>75%肿瘤细胞CLDN18.2中等或强表达为最终的cutoff值（表1）。

表1  Zolbetuximab相关的主要临床试验

除此之外，创胜的CLDN18.2单抗（TST001）在I期临床试验（NCT04495296）中采用了≥40% 肿瘤细胞中等或强表达 CLDN18.2为入组条件，后期可能会根据临床试验的结果进行进一步分析，确定最终的cutoff值11。

除此之外，国内外众多药企也在CLDN18.2单抗的道路上奋起直追，大多采用的是CLDN18.2阳性作为入组条件进行探索，由于公开披露的信息有限，具体的检测策略暂不做详述。

CAR-T相关药物

根据PD-1药物的经验，不同的药物的伴随诊断检测有着不同的cutoff值。若是不同类型的药物，cutoff值的确定也需要结合临床试验结果进行探索。在CLDN18.2 CAR-T领域，科济公司目前是走在全球领先地位的。

CT041是科济药业开发针对CLDN18.2靶点的全球首款CAR-T产品，用于治疗CLDN18.2阳性实体瘤。在Ⅰb期临床研究中，采用的cutoff值为≥10%的肿瘤细胞claudin18.2表达，染色强度≥1+。尽管相比于单抗药物，该试验采用了比较保守的cutoff值，但CT041仍表现出较好的治疗结果（图5），其中针对所有患者ORR达到48.6%(95% CI, 31.9-65.6)，DCR为73.0%；针对胃癌患者ORR达到57.1% (95% CI, 37.2-75.5)。在亚组分析的过程中，在不同CLDN18.2表达水平的亚组中（低表达，中表达和高表达），ORR相当（表2）。这表明对于CAR-T药物CT041，在CLDN18.2表达不高的患者都能起到较好的治疗效果，这无疑增加了潜在的获益人群，也为后期的cutoff值确定奠定了基础13。鉴于前期的良好数据，目前该药物已启动Ⅱ期试验，并完成了首例患者入组，具体cutoff值信息暂未披露，估计不会有大的变化。

 图5 CT041治疗后的情况变化

表2 CT041治疗后胃癌不同claudin18.2表达状态下的ORR

LB-1904是由传奇生物开发，靶向CLDN18.2的CAR-T细胞疗法。目前已经进入临床I期试验，用于治疗CLDN18. 2阳性的胃癌或胰腺癌。根据公开的信息，CLDN18.2阳性并未详细定义，这里就不详述了。除CT041和LB-1904外，国内公司北恒生物、隆耀生物和凯地生物也布局了相关CAR-T产品，靶向治疗实体瘤或消化道肿瘤，期待能有更好的结果出现。

ADC

2021年6月，石药集团发布公告， 经NMPA批准，其ADC药物SYSA1801获批临床研究（NCT05009966），在剂量爬坡阶段采用的是IHC ≥ 1+，剂量扩展阶段采用的也是类似FAST研究中≥40% 肿瘤细胞IHC ≥ 2+ CLDN18.2表达为入组条件14。

康诺亚公司CMG901 为首个在中国及美国取得临床试验申请的CLDN18.2 ADC。2021年3月，FDA批准CMG901进行G/GEJ癌I期临床试验的申请（NCT04805307）,该试验计划入组162名已知CLDN18.2状态的患者，评价CMG901的安全性、耐受性、药代动力学和抗肿瘤活性，即并不要求患者CLDN18.2是阳性，估计会在不同的亚组中对CLDN18.2的表达状态有要求。

荣昌生物RC118 于2021年7月19日向NMPA提交RC118在国内的临床试验申请，目前已获批临床。2021年11月完成澳大利亚Ⅰ期临床研究首例患者给药。此外，恒瑞医药、君实生物和科伦药业等也布局了CLDN18.2 ADC产品管线。

双特异抗体药物

双抗药物方向，AMG-910进度最快。AMG-910是安进（Amgen）和百济神州联合开发的CD3/CLDN18.2双特异性抗体，也是首个在我国申报临床的CLDN18.2双抗。AMG-910采用HLE-BiTE技术，延长药物半衰期，通过与肿瘤细胞CLDN18.2和T细胞CD3结合，招募T细胞定向杀伤肿瘤细胞。2020年7月1日获得CDE的临床试验受理。目前正在开展的Ⅰ期临床研究（NCT04260191），旨在评估AMG 910治疗CLDN 18.2阳性的G/GEJ腺癌患者的安全性、耐受性、药代动力学和疗效。

继AMG-910之后，国内启愈生物Q-1802（PD-L1/CLDN18.2双抗）、天镜生物ABL111（4-1BB/CLDN18.2双抗）、普米斯PM1032（4-1BB/Claudin18.2双抗）也先后获批临床。

总结

目前针对CLDN18.2靶点的生物药层出不穷，入组cutoff值也不尽相同。安斯泰来的Zolbetuximab通过Mono研究和FAST研究基本确定了CLDN18.2阳性肿瘤细胞占比≥75%，染色强度≥2+为cutoff值。后续的研发企业都还在cutoff值探索阶段。如科济的CT041采用claudin18.2阳性肿瘤细胞占比≥10%，染色强度≥+为入组条件；石药集团的SYSA1801在剂量爬坡阶段采用的是IHC ≥ +，剂量扩展阶段采用≥40% 肿瘤细胞CLDN18.2表达≥ 2+为入组条件；其他厂家在探索的时候大多采用CLDN18.2阳性入组；个别厂家采用CLDN18.2阴阳性均可入组。考虑不同的药物作用机制和有效性不同，cutoff值可能不同。同类产品的cutoff值设定虽然有一定的参考性，但是免疫组化检测的cutoff值影响因素较多，如药物类型，药效，诊断抗体特异性以及检测平台的稳定性等都是重要的影响因素，重要的是结合具体产品的作用机制和实际的有效性结果选择适合的检测。

为此，参考公开的文章及主要临床试验，基于当前最稳定的Ventana免疫组化自动染色平台，熙宁生物建立了CLDN18.2免疫组化的检测方法(图6)，可为广大客户提供稳定高效的临床试验阶段样本检测服务，欢迎垂询。

图片待补充

图6  免疫组化法检测肿瘤中CLDN18.2表达结果示例

参考文献

1. Klamp T, Schumacher J, Huber G, Kühne C, Meissner U, Selmi A, Hiller T, Kreiter S, Markl J, Türeci Ö, Sahin U. Highly specific auto-antibodies against claudin-18 isoform 2 induced by a chimeric HBcAg virus-like particle vaccine kill tumor cells and inhibit the growth of lung metastases. Cancer Res. 2011 Jan 15;71(2):516-27. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-10-2292. Epub 2011 Jan 11. 

2. Türeci O, Koslowski M, Helftenbein G, Castle J, Rohde C, Dhaene K, Seitz G, Sahin U. Claudin-18 gene structure, regulation, and expression is evolutionary conserved in mammals. Gene. 2011 Aug 1;481(2):83-92. doi: 10.1016/j.gene.2011.04.007. Epub 2011 May 4. 

3. Sahin U, Koslowski M, Dhaene K, et al. Claudin-18 splice variant 2 is a pan-cancer target suitable for therapeutic antibody development. Clin Cancer Res. 2008;14(23):7624-7634. doi:10.1158/1078-0432.CCR-08-1547

4. Pellino A, Brignola S, Riello E, et al. Association of cldn18 protein expression with clinicopathological features and prognosis in advanced gastric and gastroesophageal junction adenocarcinomas. J Pers Med. 2021;11(11). doi:10.3390/jpm11111095

5. Wöll S, Schlitter AM, Dhaene K, et al. Claudin 18.2 is a target for IMAB362 antibody in pancreatic neoplasms. Int J Cancer. 2014;134(3):731-739. doi:10.1002/ijc.28400

6. Sahin U, Türeci, Manikhas G, et al. FAST: a randomised phase II study of zolbetuximab (IMAB362) plus EOX versus EOX alone for first-line treatment of advanced CLDN18.2-positive gastric and gastro-oesophageal adenocarcinoma. Ann Oncol. 2021;32(5):609-619. doi:10.1016/j.annonc.2021.02.005

7. Jiang H, Shi Z, Wang P, Wang C, Yang L, Du G, Zhang H, Shi B, Jia J, Li Q, Wang H, Li Z. Claudin18.2-Specific Chimeric Antigen Receptor Engineered T Cells for the Treatment of Gastric Cancer. J Natl Cancer Inst. 2019 Apr 1;111(4):409-418. doi: 10.1093/jnci/djy134. PMID: 30203099.

8. Moentenich V, Gebauer F, Comut E, Tuchscherer A, Bruns C, Schroeder W, Buettner R, Alakus H, Loeser H, Zander T, Quaas A. Claudin 18.2 expression in esophageal adenocarcinoma and its potential impact on future treatment strategies. Oncol Lett. 2020 Jun;19(6):3665-3670. doi: 10.3892/ol.2020.11520. Epub 2020 Apr 7. 

9. Micke P, Mattsson JS, Edlund K, Lohr M, Jirström K, Berglund A, Botling J, Rahnenfuehrer J, Marincevic M, Pontén F, Ekman S, Hengstler J, Wöll S, Sahin U, Türeci O. Aberrantly activated claudin 6 and 18.2 as potential therapy targets in non-small-cell lung cancer. Int J Cancer. 2014 Nov 1;135(9):2206-14. doi: 10.1002/ijc.28857. Epub 2014 Apr 8. PMID: 24710653.

10. Türeci O, Sahin U, Schulze-Bergkamen H, Zvirbule Z, Lordick F, Koeberle D, Thuss-Patience P, Ettrich T, Arnold D, Bassermann F, Al-Batran SE, Wiechen K, Dhaene K, Maurus D, Gold M, Huber C, Krivoshik A, Arozullah A, Park JW, Schuler M. A multicentre, phase IIa study of zolbetuximab as a single agent in patients with recurrent or refractory advanced adenocarcinoma of the stomach or lower oesophagus: the MONO study. Ann Oncol. 2019 Sep 1;30(9):1487-1495. doi: 10.1093/annonc/mdz199. 

11. Pellino A, Brignola S, Riello E, et al. Association of CLDN18 Protein Expression with Clinicopathological Features and Prognosis in Advanced Gastric and Gastroesophageal Junction Adenocarcinomas. J Pers Med. 2021;11(11):1095. Published 2021 Oct 26. doi:10.3390/jpm11111095

12. https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT04495296

13. Annals of Oncology (2021) 32 (suppl_5): S1040-S1075. 10.1016/annonc/annonc708

14. https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT05009966