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PART 01
流式细胞术简介
流式细胞术在生物学及医学相关领域应用广泛，其以流式细胞仪为技术支撑，细胞或其他微粒与相应的荧光素偶联蛋白或抗体结合，在特定波长的发射光源激发下，荧光素会发射出特定波长的光谱，这些光谱能够被信号接收器接收，通过光电转换器，将荧光信号转换为电信号，从而呈现在软件界面。
图1 流式细胞仪工作原理示意图及物理参数、荧光参数下分群效果示意图
流式细胞术在药物研发与治疗、临床诊断中应用：
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细胞治疗：药代/药效动力学检测，了解细胞治疗药物体内扩增及代谢情况，了解靶细胞杀伤及重建情况，且通过分析给药前后记忆、效应、活化、耗竭细胞表达情况，进一步阐释药物作用机理及监控药效；
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药物研发和筛选：受体占位，补体沉积，体外毒性研究等；
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表观遗传学应用：蛋白翻译后修饰（如甲基化、乙酰化、磷酸化等），细胞通讯，钠氢转运体活性，脂筏结合蛋白等；
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免疫系统评估：免疫分型，功能亚群评估等；
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血液疾病诊断和治疗：微小残留病，血小板，网织红细胞，阵发性睡眠性血红蛋白尿等
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疾病诊断：CD64在感染性疾病诊断中应用广泛，HLA-B27与多种疾病高度相关；
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肿瘤学方向：细胞周期、凋亡、坏死、DNA倍体分析等；
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移植：组织交叉配型，HLA特异性抗体筛查，CD34+绝对计数等。
图2 流式细胞术在药物研发与治疗、临床诊断中的应用
流式细胞术在自身免疫性疾病中应用：
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自身免疫性疾病是由于免疫系统异常激活，产生针对自身组织和细胞的抗体或免疫细胞，导致组织损伤和器官功能障碍的一类疾病。常见的自身免疫性疾病有系统性红斑狼疮（SLE）、免疫性血小板减少症（ITP）、类风湿关节炎（RA）、自身免疫性溶血性贫血（AIHA）、干燥综合征（SjD）、强直性脊柱炎（AS）、多发性硬化症（MS）、肾小球肾炎（GN）等。
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流式细胞术通过检测免疫细胞数量、比例和功能状态，从而对患者的免疫系统进行监测，评估治疗的有效性和持续性，指导治疗方案的制定和调整。
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如在系统性红斑狼疮患者中，常常会出现T细胞和B细胞的失衡；在类风湿关节炎患者中，T细胞的活化和炎症因子的分泌增加；强直性脊柱炎特征是先天和先天样免疫细胞的异常活动……
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如“B细胞指导方案”用于利妥昔单抗（RTX）治疗后复发或维持治疗： 通过监测外周血CD20+/CD19+ B细胞数量，在B细胞数量恢复（CD19+ B细胞≥5个/mm3）时，追加RTX剂量，对患者维持治疗、减少复发时有效。参考《利妥昔单抗在肾小球肾炎中应用的专家共识》。
PART 02
SLE临床治疗及潜在治疗靶点
SLE是自身免疫介导的、以免疫性炎症为突出表现的弥漫性结缔组织病，该病以血清中出现抗核抗体为代表的多种自身抗体及多系统、多器官受累为主要特征，具有极高的异质性，临床表现多样，预后差异较大。
临床上治疗SLE的常用药物包括糖皮质激素（简称激素）、免疫抑制剂、丙种球蛋白和生物制剂。生物制剂包括利妥昔单抗（抗CD20的嵌合人/鼠单克隆抗体，能清除B细胞，使多数患者出现至少持续4-12月的外周血B淋巴细胞减少）、贝利单抗（B淋巴细胞刺激因子(BLyS)的抑制剂，是一种重组的完全人源化IgG2λ单克隆抗体，可与可溶性BLyS高亲和力结合并抑制其活性）。
图3 SLE潜在治疗靶点的分子途径示意图
注：以上内容主要参考《风湿免疫疾病超药品说明书用药专家共识(之二)——系统性红斑狼疮》
PART 03
流式细胞术在SLE治疗药物研发中的应用
经国家药品监督管理局药品审评中心披露临床试验默示许可用于治疗系统性红斑狼疮及相关适应症有159条（检索截止日期：2024-11-28），涉及77个产品，产品类别涵盖细胞治疗产品、抗体药物、小分子抑制剂、受体调节剂等。
流式细胞术在SLE治疗药物研发中应用广泛，涵盖细胞治疗产品的药代/药效动力学监测、抗体类药物的受体占位研究及细胞免疫分型等研究。本文重点介绍SLE相关细胞功能亚群分析。
B淋巴细胞功能亚群分析：
SLE特征为自身抗体的产生和B淋巴细胞功能的异常，靶向B细胞治疗的产品，通过分析B细胞功能亚群，可了解在治疗前、后，患者中B细胞分化情况，并了解炎症微环境中B细胞分化特征，为治疗SLE的临床作用机理提供相关支持。
下图简单概述B细胞的主要亚型、发育及相关标志物表达情况：
图4 B细胞的主要亚型、发育示意图
图片参考：Challenges and Opportunities for Consistent Classification of Human B Cell and Plasma Cell Populations. Front. Immunol. 10:2458.
图5 B细胞的主要亚型、发育及相关标志物表达情况示意图
图片来自ThermoFisher官网：B 细胞概述
T淋巴细胞功能亚群分析：
SLE是由于过度活跃的免疫系统对外来刺激的反应过于激进，导致产生抗核抗体的B细胞和抗体反应增强的T细胞处于过度兴奋状态。靶向T细胞治疗及T细胞功能亚群评估对SLE临床检测有重要意义。
表1 目前正在研究或开发用于SLE治疗的T细胞通路靶向药物汇总表
图片参考：T Cells in Systemic Lupus Erythematosus, Rheum Dis Clin North Am. 2021 August ; 47(3): 379–393. doi:10.1016/j.rdc.2021.04.005.
PART 04
熙宁生物|精翰生物流式平台在SLE治疗中相关检测经验
B淋巴细胞功能亚群分析：
B细胞功能亚群分析在靶向B细胞的细胞治疗产品、抗体类药物中应用广泛，基于文献中亚群指标有一定差异，熙宁|精翰基于文献调研[1]、[2]、[3]、[4]、[5]、[6]及早期探索，开发测试panel可供参考：
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指标：CD45，CD19，CD20，CD21，CD27，IgD，CD11c，CD38；
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亚群： Naive/Memory/Switched memory/DN2/Plasma/Age-associated B/Active naïve；
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熙宁|精翰有SLE基质采购途径，可快速启动方法学。
图6 B细胞分型-技术路线
图7 设门策略示意图
图8 分群效果示意图
表2 方法学测试数据（特殊采血管1）
备注：测试使用SLE基质，稳定性可达96h，规格3mL/9mL
表3 方法学测试数据（特殊采血管2）
备注：测试使用SLE基质，稳定性72h，规格5mL（含检测及备份）
表4 样品采集及运输
熙宁|精翰测试方法，B细胞功能亚群稳定性可达96h，适合多中心研究，且中心处理简单便捷，结果一致性较佳。
T淋巴细胞功能亚群分析：
熙宁|精翰已有多个T细胞功能亚群检测经验，panel信息供参考：
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检测L/D、CD45、 CD3、CD4、CD8a、CD62L、PD1、TIM3、CCR7、CD137、CD39、CD45RA、TIGIT、BTLA、CD28、CD27、CD69；
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检测L/D、CD45、CD3、CD4、CD8、CD62L、PD1、TIM3、CCR7、LAG3、CD25、CD45RA、CD27、CD69；
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检测组1-CD80、CD86、PD-L1、CD289、CD3、CD14、CD16、CD19、CD20、CD56、CD33、CD11b、HLA-DR、CD15、CD141、CD123；组2-CD3、CD4、CD8、CD25、Ki67、Foxp3、CD45RA、CCR7、PD-1、ICOS；
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检测组1- L/D、CD45、CD3、CD4、CD8、CD25、CD127、CD45RO、CCR7、CD62L、CD27、CD28、CD69、4-1BB、CD39、CD103、HLA-DR、PD1、TIM3、CD57、CX3CR1；组2- L/D、CD45、CD3、CD4、CD8、PD1、LAG3、TIM3、CD244、CTLA-4、Tigit、CXCR5、CD57、KLRG1、CD56、CD16、CD314、CD226、CD9、CD49a、CD159a、CD335；
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CD3、CD4、CD8、HLA-DR、CD45、CD152、CD279、CD197、CD45RA、CD38；
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CD45、CD3、CD4、CD8、CD25、CD127、CD45RA、CD197(CCR7)、CD45RO、CD366（Tim-3）、CD279（PD-1）、CD223（LAG-3）、TCR β。
图9 冻存全血T细胞分型-技术路线（示例）
表5 冻存全血样品采集&运输
熙宁|精翰自主开发的全血冻存方案可用于细胞亚群分析，样品可实现冻存批量运输及检测，相比传统新鲜检测模式，可显著降低运输、检测成本，整体运营成本可降低约2/3；操作简便，无需特殊仪器设备和耗材，对临床中心要求很低。流式平台配备光谱Cytek NL-CLC（3 激光，38通道），可实现多指标同时分析，节省样品量的同时减少分管检测消耗的抗体、耗材等费用，目前已有20+项目在光谱平台上稳定运行。
PART 05
熙宁生物|精翰生物流式平台可支持业务及相关检测经验
熙宁|精翰流式细胞团队由30余名经验丰富的人员组成，配备BD流式细胞仪、Beckman流式细胞仪、Cytek光谱流式细胞仪等仪器和设备，支持过包括抗体类药物、基因与细胞治疗药物、小分子创新药等各类新药的流式分析检测，其中抗体药物>40个，基因与细胞治疗药物>50 个，小分子创新药>20 个，临床试验>100 个，更是支持国内第一款I 类新药的CAR-T产品- 药明巨诺倍诺达®（瑞基奥仑赛注射液）的样本检测分析工作。平台能够支持包括免疫细胞亚群分型检测，细胞治疗产品的PK/PD 分析，抗体药物的受体占位分析，PD指标蛋白磷酸化、甲基化、乙酰化检测，胞内因子检测等。尤其在血液肿瘤淋巴细胞亚群检测中具有大量的实战经验，欢迎咨询沟通。
参考文献：
[1] C.Wei, J. Anolik., et al., A New Population of Cells Lacking Expression of CD27 Represents a Notable Component of the B Cell Memory Compartment in Systemic Lupus Erythematosus, J Immunol 2007; 178:6624-6633, doi: 10.4049/jimmunol.178.10.6624.
[2] D. Ramsköld, I. Parodis, T. Lakshmikanth, et al., B cell alterations during BAFF inhibition with belimumab in SLE, EBioMedicine, https://doi.org/10.1016/j.ebiom.2018.12.035.
[3] Scott A. Jenks, Kevin S. Cashman, et al., Extrafollicular responses in humans and SLE, Immunol Rev. 2019 March; 288(1): 136–148. doi:10.1111/imr.12741.
[4] Scott A. Jenks, Kevin S. Cashman, et al., Distinct effector B-cells induced by unregulated Toll-like receptor 7 contribute to pathogenic responses in Systemic Lupus Erythematosus, Immunity. 2018 October 16; 49(4): 725–739.e6.
[5] L.Yuzi, L.zhanguo., et al., Double-negative (DN) B cells: an under-recognized effector memory B cell subset in autoimmunity, Clin Exp Immunol. 2021;205:119–127.
[6] Belouski SS, Wallace D, Weisman M, Ishimori M, Hendricks L, Zack D, Vincent M, Rasmussen E, Ferbas J, Chung J. Sample stability and variability of B-Cell subsets in blood from healthy subjects and patients with systemic lupus erythematosus. Cytometry Part B 2010; 78B: 49–58.
