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免疫治疗是一种激活体内免疫系统的肿瘤治疗方法，在当前肿瘤治疗领域起着非常重要的作用。其通过多种手段作用于肿瘤微环境中的各种组分，如靶向CTLA4、PD-1的免疫检查点抑制剂[1]，或者改造相关免疫细胞增强其杀伤能力的细胞免疫疗法，包括CAR-T,CAT-NK以及CAR-macrophage等[2]，或者来自于肿瘤细胞的新生抗原或相关抗原的肿瘤疫苗[3]以及通过调控免疫应答的细胞因子疗法[4]等。在肿瘤的免疫治疗领域，深入探索肿瘤微环境的动态变化对于了解免疫治疗药物的作用机制以及耐药机制，寻找新的预测性或预后生物标记物，探索新的药物靶点等有着重大的意义。
PART 01
肿瘤微环境
肿瘤微环境（TME）是一种非常复杂且动态变化的生态系统，除了肿瘤细胞外，其中还包含着丰富多样的免疫细胞、癌症相关成纤维细胞 (CAF)、内皮细胞 (EC)、周细胞以及因组织而异的其他细胞类型。不同细胞通过不同的作用机制发挥相应的作用。根据各种细胞肿瘤微环境中的主要功能可将这些细胞分为肿瘤细胞、免疫细胞和支持细胞三大类。这些细胞之间相互作用，形成了功能复杂的肿瘤微环境[5]。
图1 肿瘤微环境中的组分与状态
如图1所示，在肿瘤微环境中存在多种免疫浸润细胞，主要分为T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞等。肿瘤免疫治疗主要就是通过增强相关免疫细胞的功能，解除免疫微环境内的免疫检查点抑制路径或消减肿瘤抑制免疫细胞数量等多种方式达到治疗肿瘤的效果[6]。
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CD8+ T细胞是抗肿瘤免疫应答的核心，是在抗肿瘤过程中发挥强大作用的效应细胞，通常在活化后分化为细胞毒性T细胞（CTL），能够特异性地杀伤靶细胞。通常肿瘤内的CD8+T细胞具有功能耗尽或免疫抑制的特点，免疫检查点抑制剂旨在通过解除这种抑制从而发挥作用；
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调节性T细胞（Treg）主要以FoxP3为主要标志物，在肿瘤微环境中会减弱T细胞的活性，促进肿瘤微环境的免疫抑制，起到一个刹车的效果；
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巨噬细胞以CD68为主要标记物，主要分为两种，即M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞。M1型巨噬细胞发挥促炎和抗瘤作用，但TME中的肿瘤相关巨噬细胞（TAM）为M2型，通过分泌IL-10、VEGF、精氨酸酶、金属基质蛋白酶等促进血管生成和肿瘤侵袭；
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NK细胞的主要标记物是CD56，会释放颗粒酶和穿孔素杀伤靶细胞，但在TME中富集的TGF-β会抑制其杀伤活性；
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B细胞的主要标记物为CD20，是体液免疫的关键介质，可以驻留在肿瘤内三级淋巴结构 (TLS) 中，通过抗原呈递促进T细胞激活；
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肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）主要分布于血管周围或肿瘤外周纤维间质内，分泌细胞因子、ECM成分及相关酶分子，是TGF-beta的主要来源，能够抑制肿瘤中的大多数免疫细胞，促进肿瘤的增值和转移。
PART 02
mIHC技术与肿瘤免疫微环境
鉴于肿瘤微环境中肿瘤细胞、免疫细胞、支持细胞间复杂的相互作用，在免疫治疗相关药物的开发中搞清楚肿瘤微环境的状况和变化趋势，对于理解药物的作用机理，寻找潜在的预测性指标，开发新的药物靶点等各方面非常重要。mIHC技术可以在一张组织切片上同时检测多种标记物，进而通过图像分析软件获得各种标记物的数量、组合、空间分布等信息，直观高效地对肿瘤微环境进行观察和分析，这些是其他技术手段不具备的直观信息，对于肿瘤微环境的研究起着不可替代的重要作用。
优势1 ：mIHC技术与金标准方法的一致性高
随着mIHC技术的发展，相关的技术手段也越来越成熟，与普通单标免疫组化技术的一致性较高，在不同机构间的重复性也较好，这些都使得其结果的可信度大大提升，进一步拓展了应用的场景。
一项研究[3]显示，通过常规IHC、单色IF和mIHC三种染色方法，对每种标记表型为“阳性”的细胞百分比进行定量比较。对于每个标志物，每个样本（n=5 个 NSCLC 档案样本）获取 10 个 HPF，并对阳性细胞百分比进行平均。结果显示：DAB显色常规IHC 、单色IF和mIHC相比，每个标记物的阳性细胞百分比证明了所有三种染色方式的等效性。
图2 mIHC技术与金标准方法的一致性
优势2 ： mIHC技术在不同机构间的一致性高
在一项多机构的多重免疫荧光重复性评估（MITRE）研究[3]中，6家研究机构使用了mIHC技术方案，来验证基于肿瘤组织样本中的PD-1/PD-L1表达结果的一致性。结果表明: 在IC密度、表达方面，室间一致性很高。
图3 mIHC技术在不同机构间的一致性
总之，mIHC技术作为新兴的肿瘤免疫微环境研究的主要工具，能够准确，稳定，直观地反应免疫微环境的动态变化，在肿瘤微环境的研究中发挥了越来越重要的作用，是肿瘤微环境研究不可或缺的利器。
PART 03
熙宁生物｜精翰生物mIHC平台简介
熙宁生物｜精翰生物组织病理实验室mIHC平台配备了高标准的徕卡Bond Rx全自动免疫组化染色机、Akoya PhenoImager全光谱成像系统以及Halo数字病理图像分析平台等重量级设备及分析系统，可提供自动化、高质量的mIHC研究全流程解决方案，从panel设计，panel验证，以及样本检测等提供全方位的支持，可为广大药企朋友提供高品质的临床前、临床试验阶段的组织样本mIHC检测。
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参考文献：
[1] Alsaab, Hashem O et al. “PD-1 and PD-L1 Checkpoint Signaling Inhibition for Cancer Immunotherapy: Mechanism, Combinations, and Clinical Outcome.” Frontiers in pharmacology vol. 8 561. 23 Aug. 2017, doi:10.3389/fphar.2017.00561
[2] Pan, Kevin et al. “CAR race to cancer immunotherapy: from CAR T, CAR NK to CAR macrophage therapy.” Journal of experimental & clinical cancer research : CR vol. 41,1 119. 31 Mar. 2022, doi:10.1186/s13046-022-02327-z
[3] Giarelli, Ellen. “Cancer vaccines: a new frontier in prevention and treatment.” Oncology (Williston Park, N.Y.) vol. 21,11
[4] Zheng, Xiaohu et al. “The use of supercytokines, immunocytokines, engager cytokines, and other synthetic cytokines in immunotherapy.” Cellular & molecular immunology vol. 19,2 (2022): 192-209. doi:10.1038/s41423-021-00786-6
[5] de Visser, Karin E, and Johanna A Joyce. “The evolving tumor microenvironment: From cancer initiation to metastatic outgrowth.” Cancer cell vol. 41,3 (2023): 374-403. doi:10.1016/j.ccell.2023.02.016
[6] Piñeiro Fernández, Julián et al. “Hepatic Tumor Microenvironments and Effects on NK Cell Phenotype and Function.” International journal of molecular sciences vol. 20,17 4131. 24 Aug. 2019, doi:10.3390/ijms20174131
[7] Taube, Janis M et al. “Multi-institutional TSA-amplified Multiplexed Immunofluorescence Reproducibility Evaluation (MITRE) Study.” Journal for immunotherapy of cancer vol. 9,7 (2021): e002197. doi:10.1136/jitc-2020-002197
