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呼吸道合胞病毒（Respiratory Syncytial Virus，RSV）是全球范围内引起婴幼儿、免疫缺陷人群及老年人急性下呼吸道疾病（Acute Lower Respiratory Tract Infections，ALRTIs）的主要病原体之一，具有高度传染性和致病性，严重时会导致患者支气管炎、肺炎和哮喘的发生，给家庭造成了严重的疾病和经济负担。
RSV分为A和B两种亚型，不同亚型又包括多种基因型，在流行季节，不同基因型可同时传播，其高传染性及致死率亟需有效的预防和治疗手段。目前，多条路线制备的RSV疫苗正处于临床发展的不同阶段，其中2家已获批上市，分别为GSK的Arexvy和辉瑞的Abrysvo，均为Pre-F重组蛋白疫苗，以及Moderna MRESVIA，为mRNA疫苗。Moderna mRNA-1345也处于上市申请阶段，为mRNA疫苗。此外，预防性的单克隆抗体Palivizumab和Nirsevimab分别获批上市，用于预防新生儿和婴儿由RSV引起的下呼吸道感染。
疫苗开发的关键是能够衡量其有效性，随着越来越多的RSV疫苗和预防性药物获批上市和进入临床阶段，RSV产品的临床评价方法变得越来越重要，这主要包括中和抗体、结合抗体、病毒载量以及细胞免疫等方面的内容。
PART 01
RSV中和抗体检测
RSV疫苗和预防性药物旨在诱导强大的RSV病毒中和免疫反应，Palivizumab和Nirsevimab证明RSV中和抗体可针对 RSV引起的严重下呼吸道疾病提供被动保护，验证了RSV中和抗体与预防保护的相关性。WHO也支持使用RSV中和抗体检测作为评估RSV疫苗免疫原性的初步方法，即作为RSV预防保护性的主要血清学标志。然而，目前全球有多种不同的RSV中和抗体检测方法，开发出一种准确、高通量的RSV中和抗体检测方法，对于RSV产品临床标准化以及评估新型RSV疫苗候选物都具有重要意义，不仅有助于提高RSV产品研发的效率，而且对于全球范围内的RSV疫苗和预防药物的临床效果评估和对比也至关重要。
传统的中和抗体检测方法为噬斑减少中和试验（Plaque Reduction Neutralization Test, PRNT）和微量细胞中和试验，此外，基于ELISA、ELISpot等技术的中和抗体检测方法，可通过针对病毒蛋白的抗体对感染细胞中病毒蛋白进行检测，具有简单、快速、高通量和高度敏感性等优势，且在多种RSV疫苗和预防性药物的中和抗体检测中均有适用。如图1所示，不同RSV中和抗体检测在检测方法、病毒、细胞、显色模式、检测时长、通量等方面有所不同。图2为不同RSV疫苗和预防性药物临床试验使用的中和抗体检测方法。
图1 RSV中和抗体检测方法
图2 RSV疫苗和预防性药物临床试验中和抗体检测方法
噬斑减少中和试验（PRNT）
PRNT指的是适当稀释的血清与病毒中和后，感染细胞对形成的空斑进行定量测定的方法。尽管该方法在多种病毒中能反映出中和抗体对病毒感染宿主细胞的病理影响，但具有周期长，操作条件要求高，成本高及通量低等不足之处。
微量细胞中和试验（CPE）
微量细胞中和试验指的是连续稀释的病毒与血清中和后，感染细胞，根据是否存在细胞病变效应(Cytopathic Effect，CPE)进行定量测定的方法。但该方法检测周期较长，且不同的实验人员对于细胞病变的判定标准不同，这在很大程度上会造成不可避免的人为误差。
微孔病毒中和试验，检测病毒蛋白含量
基于ELISA或ELISpot的中和抗体检测方法，可通过针对病毒蛋白的抗体对感染细胞中病毒蛋白进行检测，具有高度敏感性和可重复性，且在多种病毒中和抗体检测中均可适用，如RSV、流感病毒、SARS-CoV-2等。
如图3所示，RSV中和抗体和RSV病毒预先孵育，然后加入HEp-2细胞再进行一定时间的孵育，通过ELISA方法检测RSV抗原含量来反映中和抗体的中和病毒效果。
图3 RSV微孔病毒中和后检测病毒蛋白含量
病毒报告基因中和试验
该方法为基于RSV-GFP/Luciferase重组病毒的微量细胞中和试验法，将一定浓度的样本、RSV中和抗体与含报告基因（GFP/Luciferase）的RSV病毒预先孵育，然后加入HEp-2细胞再进行一定时间的孵育，通过检测细胞的荧光信号或者luciferase的表达来反映中和抗体的中和病毒效果。
图4 RSV病毒报告基因中和试验
PART 02
小结
熙宁生物|精翰生物以分析科学为核心能力，为新药临床与临床前研究提供专业技术服务。在疫苗临床研究领域，我们拥有完善的检测平台和一站式检测服务能力，开发了基于ELISA、Fluorescence、Luminescence高通量的中和抗体评估方法，具有基于ELISpot、ICS的细胞免疫检测能力，支持中美、中澳、多中心、大样本量的临床试验，有着丰富的海外样品进口经验。
熙宁生物|精翰生物在RSV临床研究领域的项目检测经验非常丰富，可提供一体化、高效率的临床生物分析服务，包括：
➢
微孔病毒中和法进行血清中RSV-A和RSV-B中和抗体滴度检测；
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ELISA/MSD方法进行血清中RSV 抗F蛋白的特异性抗体浓度检测；
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RT-qPCR方法进行RSV病毒载量检测；
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ELISPOT和ICS方法进行RSV抗原多肽特异性T细胞反应检测；
熙宁生物|精翰生物可高效助力RSV疫苗和药物领域临床研究的开展，欢迎大家后台留言咨询交流。
参考文献：
[1] 疫苗临床试验抗体分析方法研究技术指导原则
[2] Development of a High-Throughput Respiratory Syncytial Virus Fluorescent Focus-Based Microneutralization Assay
[3] RSV neutralization assays – Use in immune response assessment
[4] Expansion of the 1st WHO international standard for antiserum to respiratory syncytial virus to include neutralisation titres against RSV subtype B An international collaborative study
[5] An Improved and High Throughput Respiratory Syncytial Virus (RSV) Micro-neutralization Assay
