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呼吸道合胞病毒（Respiratory Syncytial Virus，RSV）是全球范围内引起婴幼儿、免疫缺陷人群及老年人急性下呼吸道疾病（Acute Lower Respiratory Tract Infections，ALRTIs）的主要病原体之一，具有高度传染性和致病性，严重时会导致患者支气管炎、肺炎和哮喘的发生，给家庭造成了严重的疾病和经济负担。
研发有效的RSV疫苗成为预防RSV感染的重要手段之一，此前数十年间，科学家们不曾停止对于RSV疫苗的研究与开发，但均以失败告终。2023年，FDA相继批准了葛兰素史克（GSK）的Arexvy和辉瑞（Pfizer）的Abrysvo两款RSV疫苗，用于预防60岁及以上人群中由呼吸道合胞病毒（RSV）引起的下呼吸道疾病，实现了RSV疫苗和药物开发领域近60年来里程碑式的突破。
PART 01
Pre-F蛋白为RSV疫苗研发的关键抗原
关键抗原的选择是RSV疫苗研发成功的关键，F蛋白和G蛋白对RSV病毒的黏附和入侵十分重要，也是病毒表面的主要保护性抗原，二者都可以成为RSV研发的理想靶点。然而由于G蛋白变异较多相对不稳定，基于Pre⁃F蛋白的RSV疫苗具有较高的安全性和免疫原性，适用于儿童、孕妇、成人和老年人群。
F蛋白具有黏附和融合功能，可介导病毒粒子进入细胞，形成合胞体。在RSV感染过程中，F 蛋白首先采用亚稳态的融合前F 蛋白（ Pre-fusion Protein，Pre-F） 表达在病毒包膜表面，当与宿主细胞膜接触后，结构重排为高度稳定的融合后F 蛋白（ Post-fusion Protein，Post-F），存在Pre-F和Post-F构象变化。
图1 RSV Pre-F和Post-F蛋白结构和抗原位点[1]
Pre⁃F蛋白具备6 种抗原表位，即SiteⅠ、II、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ø，而Post⁃F仅包含Pre⁃F的前4种表位。研究表明，可诱导更强中和抗体活性的抗原表位Site Ⅴ和Site Ø均位于Pre⁃F蛋白中，尤其是Site Ø诱导的中和抗体活性最高（位于Pre⁃F顶端）。因此，诱导高滴度的中和抗体是开发RSV疫苗的主要目标，血清中大多数RSV中和活性仅针对Pre⁃F抗原位点，具有特异性抗原表位的Pre⁃F蛋白则成为最热门的RSV疫苗靶标。
PART 02
RSV疫苗临床进展
RSV疫苗的开发始于1957年首次在人类中发现RSV病毒后不久。1960年代便开发了FI-RSV疫苗，并在婴儿身上进行了临床试验。疫苗病毒通过细胞培养产生，用福尔马林灭活，并与明矾混合作为佐剂。然而，FI-RSV主要表达Post-F构象而非Pre-F构象，该疫苗不仅未能保护血清阴性的婴儿免受RSV的侵害，还诱发严重的增强型呼吸道疾病（Enhanced Respiratory Disease，ERD），导致80%的受试婴儿住院治疗，并导致2人死亡。ERD的部分原因为福尔马林导致疫苗制剂中和表位的破坏，FI-RSV注射可导致免疫紊乱，表现为CD4+T细胞数量和Th2细胞因子水平增加，同时，CD8+T细胞数量和Th1细胞因子水平降低，可能也有助于ERD。因此，在血清阴性儿童中开发灭活疫苗和蛋白质疫苗时，必须考虑ERD发展的潜在风险。基于此影响，RSV疫苗的开发推迟了几十年，目前有五种类型的RSV疫苗正在开发中，即基于颗粒的、基于载体的、减毒活疫苗或嵌合疫苗、亚单位疫苗和mRNA疫苗。
图2 RSV免疫策略[2]
图3 RSV疫苗临床进展[2]
Arexvy
2023年5月4日，FDA批准葛兰素史克公司的RSV疫苗Arexvy上市，用于预防60岁及以上人群因感染RSV引发的下呼吸道疾病（LRTD），这是全球首款获批用于老年人的RSV疫苗，Arexvy由稳定的pre-F与AS01佐剂组成。
基于AReSVi-006关键性III期试验结果，Arexvy对60岁及以上成人的RSV-LRTD的保护效力为82.6%，具有显著的统计学和临床意义，达到试验主要终点。在至少患有一种基础疾病（如心血管疾病和内分泌代谢疾病）的老年人中，该疫苗的保护力为94.6%。对于重度RSV-LRTD患者（即因RSV-LRTD妨碍日常活动的患者），其保护效力为94.1%。
Abrysvo
2023年6月1日，辉瑞宣布其RSV二价疫苗Abrysvo获得FDA批准，用于预防60岁及以上成人由RSV引起的LRTD。该疫苗是一种非佐剂二价疫苗，含有来自RSV-A和RSV-B的稳定pre-F蛋白亚基。
Abrysvo III期临床试验RENOIR数据显示，Abrysvo在预防至少有两种症状的RSV-LRTD方面的有效率为66.7%，在预防有三种或以上症状感染方面的有效率为85.7%。此外，这项研究还表明，针对融合前形式蛋白的特异性抗体在阻断病毒感染方面非常有效，这表明基于Pre-F蛋白的疫苗可能对RSV起到最佳保护作用。
除60岁及以上人群外，新生儿同样为弱势群体，Abrysvo开发了另一个适应症：通过孕妇的主动免疫预防刚出生至6个月大的婴儿中由RSV引起的下呼吸道疾病和严重下呼吸道疾病。即通过给孕妇注射疫苗，降低新生婴儿的感染风险，此前，FDA已批准了Abrysvo的BLA优先审评。
图4 Abrysvo疫苗母体和婴儿血清中RSV-A、RSV-B中和抗体滴度检测[4]
2024年4月9日，辉瑞宣布其研究开发的RSV疫苗（ Abrysvo） 的一项III期临床研究获得积极结果，透露出Abrysvo将有望用于18~59岁的成人因呼吸道合胞病毒引起的下呼吸道疾病（RSV-LRTD）的积极信号，有望成为全球首款针对18岁及以上成年人的RSV疫苗。
mRNA疫苗
mRNA可以通过设计编码序列来编码稳定的F蛋白构象，编码天然RSV F蛋白或稳定的Pre-F构象的mRNA疫苗也通过使用阳离子纳米颗粒和LNP成功递送。莫德纳开发并正在评估三种编码pre-F蛋白的单剂量候选疫苗，即用于成人的mRNA-1172和mRNA-1777，以及用于儿童的mRNA-1345。
图5 RSV mRNA疫苗临床进展[1]
mRNA-1777（V171）疫苗包含经化学修饰RSV pre-F的mRNA和使用了与莫德纳COVID-19 mRNA疫苗相同的脂质纳米粒（LNP）。临床I期研究在72名健康的年轻人（≥18岁，≤49岁）和107名健康的老年人（年≤60岁，≤79岁）中进行，参与者接受25，100，200或300 µg mRNA-1777（V171）或安慰剂作为单一肌肉注射剂量，主要目标是评估安全性和耐受性，次要目标评估体液和细胞介导的免疫原性。结果显示，所有剂量水平的mRNA-1777（V171）耐受性良好，未报告与疫苗相关的严重不良事件。
通过血清RSV A、RSV B中和抗体滴度，血清RSV Pre-F蛋白抗体滴度，血清RSV Pre-F蛋白D25竞争性抗体滴度等检测，mRNA-1777疫苗可引起有效的体液免疫应答。通过FACS和ELISPOT检测细胞对RSV-F多肽的免疫反应，与mRNA-1777疫苗RSV-F蛋白相关的T细胞反应也有所增加，并且主要与CD4+ T细胞亚群相关。
图6 mRNA-1777 （V171）疫苗特异性T细胞反应（IFN-γ ELISPOT检测，A 年轻人，B老年人）[5]
图7 mRNA-1777 （V171） 胞内细胞因子检测（FACS，A 年轻人，B老年人）[5]
mRNA-1345疫苗基于mRNA-1777进一步进行序列设计和密码子优化，以增强抗原的翻译表达和激活的免疫原性。临床试验结果显示，在老年人中，单次接种 mRNA-1345（50、100 或 200 μg）可使针对 RSV-A 的中和抗体滴度提高 14 倍，RSV-B提高10 倍，且老年人对疫苗的耐受性良好。基于此数据，FDA已授予mRNA-1345用于60岁及以上老年人群的快速通道资格（FTD），mRNA-1345目前处于III期临床试验阶段。
PART 03
RSV疫苗临床生物分析内容
随着越来越多的RSV疫苗获批上市和进入临床阶段，RSV疫苗的评价方法也越来越重要。RSV疫苗产品的临床生物分析主要包括RSV中和抗体、结合抗体、RSV病毒载量以及细胞免疫等内容。
图8 RSV疫苗检测的四种方法[6]
RSV中和抗体是RSV疫苗临床评价的重要指标。传统的中和抗体检测方法为噬斑减少中和试验（Plaque Reduction Neutralization Test, PRNT）和微量细胞中和试验，此外，基于ELISA、ELIspot等技术的中和抗体检测方法可通过针对病毒蛋白的抗体对感染细胞中病毒蛋白进行检测，具有简单、快速、高通量和高度敏感性等优势，且在多种RSV疫苗和预防性抗体的中和抗体检测中均有适用。
图9 RSV中和抗体检测方法[7]
PART 04
结语
熙宁生物|精翰生物以分析科学为核心能力，为新药临床与临床前研究提供专业技术服务。在疫苗临床研究领域，我们拥有完善的检测平台和一站式检测服务能力，开发了基于ELISA、Fluorescence、Luminescence高通量的中和抗体评估方法，具有基于ELISpot、ICS的细胞免疫检测能力，支持中美、中澳、多中心、大样本量的临床试验，有着丰富的海外样品进口经验。
熙宁生物|精翰生物在RSV临床研究领域的项目检测经验非常丰富，可提供一体化、高效率的临床生物分析服务，包括：
➢
细胞学方法进行血清中RSV-A和RSV-B中和抗体滴度检测
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ELISA/MSD方法进行血清中RSV 抗F蛋白的特异性抗体浓度检测
➢
RT-qPCR方法进行RSV病毒载量检测
➢
ELISPOT方法进行RSV抗原多肽特异性T细胞反应检测
熙宁生物|精翰生物可高效助力RSV疫苗和药物领域临床研究的开展，欢迎大家后台留言咨询交流。
