靶向蛋白质降解(TPD)目前主要通过泛素蛋白酶体和溶酶体降解目标蛋白，根据具体作用原理又可细分为近10个不同技术路线，其中发展最快的是分子胶和PROTAC技术。

图1 靶向蛋白质降解(TPD)不同的技术路线

图2  分子胶 VS PROTAC

PART 01

目前研发的新药大多通过E3的组成分子CRBN来降解蛋白质，主要用于MM、血液系统肿瘤和实体恶性肿瘤等疾病治疗。从作用机制来看，IKZF1/3是其中最热门的作用靶点，GSPT1、DCAF15、IKZF2、BCL-xL、SEL1L2等新靶点也陆续被开发。

图3 全球分子胶药物研发情况（不完全统计）

图4 全球PROTAC药物研发情况（不完全统计）

PART 02

SP-3164是一种阿伐度胺（AVA, CC-122）的氘稳定（S）对映异构体，同时也是一种可口服的分子胶，用于降解Ikaros和Aiolos（I/A）。相关体外研究数据表明其在多发性骨髓瘤临床前模型中具有活性，与来那度胺（LEN）、泊马度胺（POM）和阿伐度胺（AVA）相比，SP-3164更有效、更快速地降解促癌转录因子I/A，而稳定的（R）-对映异构体SP-3165既不结合CRBN也不降解I/A。在初步的体内研究中，SP-3164产生了显著的肿瘤生长抑制（TGI）。

将SP-3164降解MM.1S细胞中Aiolos的潜力与SP-3165、AVA和POM进行了比较。SP-3164以时间和剂量依赖性方式快速而有力地降解Aiolos，比AVA和POM更有效，而SP-3165表现出最弱的Aiolos降解。为了研究SP-3164对细胞存活的影响，用SP-3164（0.1μM、1μM和10μM）和SP-3165（1μM）处理NCI-H929细胞，并通过流式细胞术评估细胞凋亡。SP-3164在72小时后诱导剂量依赖性早期和晚期细胞凋亡，而SP-3165未诱导细胞凋亡。在NCI-H929小鼠异种移植模型中评估SP-3164的体内活性并与SP-3165、LEN和POM进行比较。SP-3164作为单一药物显示出显着的TGI，而SP-3165似乎支持肿瘤生长。LEN和POM表现出最弱的TGI。与POM+DEX联合使用相比，SP-3164与地塞米松（DEX）联合使用时，TGI有所改善。

同时，SP-3164可以有效降解Ikaros和Aiolos（I/A），在临床前NHL模型中显示出令人信服的活性。

NVP-DKY709，一种IKZF2（Helios）转录因子的选择性降解物，不降解IKZF1/3。研究表明，NVP-DKY709在体外可降低人调节性T细胞的抑制作用，并使耗竭Teff分泌细胞因子，降低小鼠的肿瘤生长，并降解猴子和人体内的IKZF2。

① 通过流式细胞术体外评估DKY709对T细胞和Tregs细胞的影响。

图5 A．D&E的圈门策略； B．人原代Treg细胞体外孵育10μM DKY709或DMSO的数据，包括%IKZF2+和IKZF2 MFI；C．人原代Treg细胞在DKY709作用下会扩增，并抑制Teff细胞增殖；D&E不同浓度DKY709作用于重复TCR刺激诱导的功能失调的Teff细胞，IKZF2+以及IL-2和IFN-γ水平的变化

② 通过流式细胞术评估小鼠和食蟹猴给药DKY709对T细胞和Tregs细胞的影响。

图6 A. B的圈门策略；B. 通过流式细胞术测定单次口服DKY709后食蟹猴血液中Treg细胞中IKZF2水平；C. 每日给予KLH免疫的食蟹猴指定剂量的DKY709后，通过流式细胞术测定外周血CD3+细胞中Ki67的表达水平来评估外周血T细胞的增殖能力

图7 A. B&C的圈门策略；B. 人源化小鼠MDA-MB-231肿瘤移植模型中IKZF2在原代Foxp3+ Treg细胞中的体内降解，血液(左)和肿瘤浸润(右)；C. 通过流式细胞术评估DKY709和PD1阻断治疗对肿瘤浸润性Treg细胞Foxp3 MFI和CD25表达和增殖的影响

图8 通过流式细胞术评估两例在指定时间内每天接受20mg DKY709患者外周血Tregs中IKZF2的水平

ARCC-29是一种蛋白水解靶向嵌合体（PROTAC）分子，它通过蛋白酶体诱导BET（BRD4/3/2）蛋白降解。ARCC-29 在几种人类恶性细胞系和体内啮齿动物异种移植肿瘤中降解BRD4。在前列腺（22Rv1）、DLBCL（SU-DHL-6）和卵巢（A2780）肿瘤的小鼠异种移植模型中，该分子表现出很强的PK/PD/疗效关系。从患者身上获取肿瘤组织通常需要侵入性操作，并且可能无法获得。已有相关研究开发了一种使用替代组织的检测方法来评估PROTAC的作用机制，这些机制可以应用于临床，通过流式细胞术来定量评估外周血单核细胞（PBMC）各亚群中BRD4的水平。将冷冻或新鲜的人PBMC与ARCC-29离体培养6小时，固定并透化以进行细胞内BRD4染色，并在门控淋巴细胞中定量BRD4水平。ARCC-29在四个新鲜PBMC样品中将BRD4水平降低到对照的13%、10%、16%和9%，在六个冷冻PBMC样品中降低到10%、9%、11%、6%、8%和35%，与BRD4抑制剂OTX-015作用PBMC显示出相似或更强的抑制作用。流式细胞术检测PBMC为治疗前和治疗后的患者样本在临床上确认PROTAC的作用机制提供了潜在的替代方法。

PART 03

表1 FACS熙宁|精翰部分冻存稳定性数据展示

冻存稳定性总结：

图9 各细胞亚群抑制率（％）

FACS熙宁|精翰部分临床样品数据展示。分别在给药前D1-Pre，给药后各时间点检测全血样品中各细胞亚群靶蛋白抑制率，给药后有明显抑制

表2 FACS检测胞内/核内因子相关案例经验

熙宁|精翰生物流式平台，不断进行技术迭代，开发创新。针对流式分析血液样品稳定性时间短，需要及时运输；或者是需要在临床中心分离PBMC，耗时耗力，效果不佳等行业痛点，开发了全血直接冻存技术，目前已获得国家专利授权，提高了各方的运营效率，减小了数据的批间差异，提高了数据的可比性，为行业创造了价值，受到了来自申办方和临床试验中心的一致欢迎和好评；为国际多中心临床样品的流式检测，提供了解决方案。基于全血冻存技术，熙宁|精翰开展了一系列的应用拓展，包括但不限于：

熙宁|精翰流式细胞团队由30余名经验丰富的人员组成，配备BD流式细胞仪、Beckman流式细胞仪、Cytek光谱流式细胞仪等仪器和设备，支持过包括抗体类药物、基因与细胞治疗药物、小分子创新药等各类新药的流式分析检测，其中抗体药物>40个，基因与细胞治疗药物>50 个，小分子创新药>20 个，临床试验>100 个，更是支持国内第一款I 类新药的CAR-T产品- 药明巨诺倍诺达®（瑞基奥仑赛注射液）的样本检测分析工作。平台能够支持包括免疫细胞亚群分型检测，细胞治疗产品的PK/PD 分析，抗体药物的受体占位分析，PD指标蛋白磷酸化、甲基化、乙酰化检测，胞内因子检测等。尤其在血液肿瘤淋巴细胞亚群检测中具有大量的实战经验，欢迎咨询沟通。

参考文献：

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