酶联免疫斑点技术(Enzyme Linked Immunospot Assay,简称ELISPOT)是细胞免疫学研究中最敏感的检测方法,可以在单细胞水平对抗体分泌细胞(如B细胞)及细胞因子分泌细胞(如T细胞)进行检测,可达20-25斑点/100万细胞,由于该方法是进行抗原刺激后免疫细胞的功能性检测,因此也具有极佳的生理相关性。
ELISPOT常用于疫苗领域药效学评估, 是mRNA感染性疫苗和mRNA/DC肿瘤疫苗药效学评估中关键的技术方法,也是AAV based药物细胞免疫原性评估重要的技术手段。
ELISPOT基本原理是通过免疫细胞和对应刺激物进行共培养,类似于ELISA双抗夹心法对有刺激反应的免疫细胞进行检测。由于免疫细胞激活机理的复杂性性,根据免疫细胞的来源选择,刺激物的类型,刺激方式的不同会衍生出不同的应用方向,以及不同灵敏度的ELISPOT检测方法,简要的技术流程如图1所示:
图1. ELSIPOT检测流程图
在基因治疗药物的临床生物分析实践中,细胞免疫原性检测有诸多的难点:
1. ELISPOT通常需要刺激物和对应阳性PBMC才能进行方法学验证,在实际的方法学验证过程中由于刺激物对应的阳性PBMC不易获取,的因此有些检测机构的做法是,方法并不进行验证。即使进行验证也通常采用CEF作为刺激物,筛选健康人PBMC作为阳性PBMC进行方法学的精密度,稳定性以及稳固性验证,从而证明整体平台体系的可靠性。熙宁生物秉持严谨可靠的方法开发验证质量要求,除采用CEF刺激阳性PBMC作为主体验证外,基于对于基因治疗药物原理的了解,在正式样品分析前会进行专属于该基因治疗药物的特异性较差验证,如对于AAV治疗药物,会基于AAV病毒载体存在预存的阳性PBMC,对于AAV药物的细胞免疫原性检测,筛选出健康人群体中的阳性PBMC,进行AAV衣壳蛋白多肽库的交叉验证,确保在进行样品分析前检测方法的可靠性。
2. ELISPOT的检测结果会受到样品PBMC本身的质量的影响较大,如果PBMC分离或者保藏不当,很可能会失去功能学活性,导致假阴性的结果。ELISPOT检测结果同时受到样品PBMC本身免疫状态影响,如在采集时处于免疫活跃状态,会出现较多的背景斑点,检测结果得到的斑点数会是假阴性。因此,为了得到更加真实可靠的实验结果,进行样品分析时,如图2所示,对于每一个样品均会设置CD3刺激组来监控PBMC的功能活性,Medium分组来监控PBMC的免疫背景,在此基础上进行特定抗原的检测分析。
图2. ELISPOT样品分析体系
3. ELISPOT作为最为灵敏的检测技术,结果受到的影响因素较多,样品进行分析时往往会出现异常的数据,很多供应商只汇报检测斑点结果,并不能有效的进行数据解读。熙宁生物对于ELISPOT检测技术和细胞免疫具有深刻的理解,基于CD3组的方法学验证数据得到了PBMC最小响应阈值MIR,基于Medium组的方法学验证数据得到最小效应限LOD,结合实践情况,会对每一个检测数据进行充分的结果,,确保数据的科学性和合理性。
在基因治疗药物的临床生物分析实践,细胞免疫原性检测有以下关键点:
1. 如图3展示的T细胞激活原理,ELISPOT方法学的灵敏度跟刺激物选择有关,通常情况方法的灵敏度的高低排序为,含有多肽复合物的抗原递呈细胞>多肽>蛋白/病毒颗粒。对于肿瘤疫苗和DC疫苗,由于机体免疫细胞对其反应比较温和,建议使用最为灵敏的刺激物。熙宁生物有丰富的稳转细胞株和免疫细胞培养经验,可进行有多肽复合物的抗原递呈细胞的培养和制备,设计更加复杂也更加灵敏的ELISPOT检测方法。
图3. T细胞激活原理
2. 在临床检测过程中,从全血样品采集到分离PBMC的中间时间不应超过8小时,不然分离出来的的PBMC的功能活性会受到极大影响,造成大部分样品假阴性的结果。对于这个在临床检测分析的痛点,熙宁生物自主开发了相应的方法,可将全血分离PBMC的稳定时间延长至48小时,在保证检测结果真实可靠的前提下,满足临床运营商,从从临床中心进行样本采集运输到分析实验室的可操作性,考察结果如4所示:
图4. 熙宁全血稳定性测定结果
细胞免疫原性评估对象是PBMC,但PBMC由于全血采集后的稳定性较差,且免疫背景较为复杂,使得ELISPOT的检测结果的解析变得极为复杂,甚至很多时候检测结果本身也有失真的风险。需要基于对方法和作用机理的充分理解,来保障检测的顺利进行。熙宁生物通过合理的样品分组设计,方法学参数验证确定,会对每一个临床样品的检测数据进行充分解读。同时基于临床试验样品全血采集后稳定性较短的难点,研发了一款全血稳定剂,可将全血采集后的稳定时间延长到48小时,在确保样品稳定结果真实的情况下尽可能了便利临床运营。
基因治疗作为热门的新兴疗法,近些年发展迅速。同时,基因治疗药物研发需求多样化、技术复杂度高的特点,也对检测分析带来巨大挑战。熙宁生物搭建了基于基因治疗药物检测需求的基因检测平台、细胞/病毒检测平台、流式检测平台和免疫检测平台等,能够满足研发项目在不同阶段的在生物分析需求。团队专注于GCT领域,积累了丰富的实战经验和专业的技术服务能力,通过qPCR/ddPCR技术、细胞法中和抗体检测技术、ELISPOT细胞免疫原性检测技术、流式检测技术、ELISA/MSD检测技术等多平台技术互联,打通技术隔阂,真正实现“一个临床/项目,一个生物分析实验室,一个技术项目团队”的服务方式,为基因治疗产品生物分析提供完整解决方案。