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破伤风是一种严重的公共卫生问题，由破伤风梭菌的孢子引起的急性感染性疾病。孢子在环境中无处不在，尤其是在土壤、尘灰、动物和人类的肠道/粪便，以及表皮和生锈工具如钉子、针头和铁丝网上。由于极其耐热和耐杀菌剂，孢子可以存活多年。在感染后，破伤风的潜伏期自3天至21天不等。大多数病例发生在14天内。
图1 破伤风梭菌示意图
破伤风患者自临床恢复后不能因此获得免疫，而破伤风疫苗是预防破伤风的有效途径，自应用以来明显降低了破伤风的发病率，对破伤风疾病的预防起到了极其重要的作用。破伤风疫苗免疫后产生的抗破伤风毒素的抗体在抵御破伤风方面发挥着重要作用。除疫苗制剂的主动免疫外，破伤风的被动免疫也在临床中用于破伤风的短期应急预防，其给药后破伤风毒素抗体效价水平变化是评价保护性的替代指标。因而破伤风毒素抗体效价水平的检测具备重要的意义。
本文将介绍几种常用的破伤风抗体检测方法：
PART 01
体内实验（小鼠毒素中和试验 ）
体内中和试验（In Vivo Neutralization Assay, IVN）是检测抗破伤风抗体的一种方法，被认为是衡量血清中生物活性抗毒素抗体的“金标准”方法。
体内中和试验通过在活体动物（通常是小鼠）中评估血清样本对破伤风毒素的中和能力来检测抗破伤风抗体。这种方法能够检测到低至0.001国际单位每毫升（IU/mL）的中和抗体。
实验通常在小鼠中进行，将一系列稀释的测试血清与致死剂量的破伤风毒素一起孵化，然后注射到小鼠体内。通过与国际参考血清（如TE-3 WHO参考血清）标准化，可以得到以IU/mL为单位的结果。具体实验步骤见下图：
图2 体内小鼠试验示意图
小鼠体内中和法测定破伤风抗体效价存在一定的优劣势。
优势如下：
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特异性强：小鼠体内中和法被认为是检测特异抗体效价的“金标准”，因为它能真实地反映样本的中和效价。
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灵敏度高：该方法能够检测到非常低水平的中和抗体，例如每毫升血清中0.001国际单位（IU/mL）的中和抗体。
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真实性：由于其基于生物学活性的测量，该方法能够提供关于抗体中和能力的直接证据。
劣势如下：
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成本高：小鼠体内中和法需要使用大量的实验动物，导致成本较高。
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劳动密集：该方法操作复杂，需要大量的人力来进行动物饲养和实验操作。
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时间消耗长：完成一次小鼠体内中和试验需要较长的时间，通常需要几周。
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结果变异性：由于实验动物的个体差异，以及终点选择的主观性（如疾病症状或死亡），可能会导致结果的变异性。
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缺乏国际标准化协议：目前没有国际上标准化的协议，使得不同实验室之间的结果难以直接比较。
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依赖于动物：该方法依赖于活体动物的使用，这在伦理和操作上都存在一定的限制。
PART 02
体外方法
破伤风抗体与破伤风毒素或类毒素之间的相互作用可以通过体外试验来测量，包括被动血凝试验、放射免疫测定、标准或改良的酶联免疫吸附测定（ ELISAs）以及基于磁珠的免疫荧光测定。除了放射免疫测定外，这些技术都简单、灵敏、快速且成本低廉，但它们通常比体内中和方法的特异性要低。因此，体外技术的结果应该仔细解释，并在可能的情况下与体内中和方法进行验证。
图3 试验示意图
被动凝集试验
被动血凝（Hemagglutination, HA）试验是一种简单的体外测定方法，其中破伤风毒素（Tetanus Toxin, TT）致敏的红细胞在破伤风抗体存在时会发生凝集。HA试验的可靠性受到限制，因为它主要测量IgM，而IgM并不能中和破伤风毒素。HA试验与中和试验之间的相关性是多变的。在含有高或中等滴度的血清中，HA试验与中和试验之间存在良好的相关性，但在低滴度时，由于检测到非功能性抗体，HA试验可能会高估结果。
放射免疫测定（RIA）试验
放射免疫测定（Radioimmunoassay, RIA）试验已被用来测定破伤风抗体的效价。RIA试验有几种可能的修改方式：破伤风毒素（TT）可以与不溶性吸附剂（如纤维素或琼脂糖）结合，或者像酶联免疫吸附测定（ELISA）试验中那样被动吸附到塑料表面。特异性抗体与抗原免疫吸附剂结合，并通过测量与抗原-抗体复合物结合的同位素标记的人类抗球蛋白的结合来定量。RIA试验的灵敏度高，结果与HA试验获得的值有很好的相关性。然而，RIA试验所需的试剂和设备昂贵，且该技术只能由经过高度培训的人员使用。
常规酶联免疫吸附测定（ELISA）
酶联免疫吸附测定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）是检测抗破伤风IgG抗体最常用的测定方法。 如采用间接ELISA 法（测试血清中的抗体与固定相（微孔板孔表面）上的破伤风毒素（TT）结合）。通常认为抗体浓度高于0.16-0.2 IU/mL时，间接ELISA与中和试验之间存在良好相关性。与中和试验相比，间接ELISA在低于这个范围时，可能高估了抗体水平。预测临床保护的最低ELISA值为0.16 IU/mL。
ELISA对破伤风抗毒素水平的高估和特异性不足可能归因于几个因素，例如抗体对抗原制剂中的污染物的非特异性结合，或者识别在抗原制剂中可能产生的非生物学重要表位。检测到亲和力较低的抗毒素，不足以在体内中和毒素，也可能有助于抗体水平的高估。 另一种解释可能是检测到不对称的、功能上单价的IgG抗体，这些抗体的毒素中和活性有限。
图4 酶联免疫吸附实验，间接ELISA法示意图
改良的ELISA法
改良的ELISA法检测破伤风抗体是一种经过优化的检测技术，它提供了一种快速、准确且具有良好特异性和重复性的破伤风抗体检测方法，对于评估破伤风疫苗的免疫原性和破伤风毒素抗体药的有效性提供重要的信息。改良ELISA法有多种方法，如竞争ELISA法，双抗原夹心ELISA，化学发光法，基于磁珠技术等。可基于实际需要，选择合适的方法。
PART 03
小结
血清学指标-抗毒素（类毒素）特异性IgG 被认为与保护性最为相关，开发和验证科学的方法对于破伤风疫苗/破伤风抗体药有效性的评估非常重要。
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参考文献：
[1] The immunological basis for immunization series: module3: tetanus (Immunological basis for immunization series; module 3). WHO. 2018
[2] 中国药典通则3508 破伤风抗毒素效价测定法（小鼠试验法）
[3] Wang Y, Wu C, Yu J, Lin S, Liu T, Zan L, Li N, Hong P, Wang X, Jia Z, Li J, Wang Y, Zhang M, Yuan X, Li C, Xu W, Zheng W, Wang X, Liao HX. Structural basis of tetanus toxin neutralization by native human monoclonal antibodies. Cell Rep. 2021 May 4;35(5):109070. doi: 10.1016/j.celrep.2021.109070. PMID: 33951441.
