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数字PCR通过单个模板分子的PCR扩增，摆脱了扩增效率的限制，可实现不依赖于标准曲线和参照样本的绝对定量。作为一种准确、高灵敏度的定量PCR技术，在医学、环境科学和食品安全等领域具有广泛的应用前景。
PART 01
数字PCR介绍
数字PCR检测流程可大致概括为3个步骤：
Partition 将传统PCR中的单一体系进行稀释，分散成几万个微滴，分散数量越多，每个单元中目标分子浓度越高，起始低浓度靶分子的检测可能性就越大，检测灵敏度就越高。 Amplification 每个微滴中进行独立的PCR扩增，检测灵敏度提高的同时也能够有效降低反应体系中化合物的干扰。 Analysis 扩增结束后检测各个独立反应单元的荧光信号，根据泊松分布原理进行分析，得出待测靶分子的拷贝数。
PART 02
基于泊松分布 (Poisson Distribution) 的绝对定量
数字PCR的高精确度除了与其前期样本分散有关外，另一个重要的原因就是在数字PCR检测分析中引入了泊松分布原理。
理论上，DNA分子可以平均分配到各独立的反应单元中，检测时有荧光信号就可直接判读为目标分子的拷贝数。但实际操作中，DNA分子是随机分布的，每个反应单元可能包含两个或两个以上的目标分子。
图1 理想情况下和实际情况下DNA分子分布对比
假设反应体系中总的靶基因拷贝数为m，独立的反应单元为n，每个反应单元中靶基因拷贝数：λ=m÷n ， 由于每个单元中实际包含的靶基因拷贝数是离散的（0、1、2……），那么分区中包含k个靶基因拷贝数的概率服从泊松分布：
数字PCR采用终点法检测，即使微滴中只含有1个靶基因拷贝也能被检测到，仪器通过分辨各反应单元的阴阳性情况，通过阴性反应单元的比例和样品稀释倍数（或微滴数），采用泊松分布的概率公式进行计算，即可获得样品的拷贝数浓度，实现DNA的精确定量。
PART 03
数字PCR方法验证
数字PCR以其更高的准确度及灵敏度等优势，在基因和细胞治疗产品的生物分析领域得到了日益广泛的应用。2020年和2021年的《生物分析白皮书》深入讨论了qPCR和dPCR之间的差异。在2021年的专家共识建议基础上，2022年的GCC白皮书从CRO的角度出发，对dPCR的开发和验证达成了更多共识。目前，数字PCR平台建议的验证项包括精密度、准确度、灵敏度、选择性、定量下限和稳定性等关键指标。
微滴数量（对于微滴式数字PCR）
根据使用仪器的不同，实验可生成的微滴数量也各有差别，微滴数量过低不适用于泊松分布，检测结果可信度也将变低，方法验证中应设定合适的接受标准。
标准曲线
区别于qPCR检测，数字PCR仅在验证阶段需要在分析批中设置标准曲线，用于验证方法的准确度、精密度及线性范围；样品分析中，数字PCR无需标准曲线参与计算即可得出待测样品的拷贝数结果。
对于浓度≥50 copies/20 μL反应体系的标准曲线点，接受标准为%RE在±35 %以内，%CV ≤40%；对于浓度＜50 copies/20 μL反应体系的标准曲线点，接受标准为%RE在±50 %以内，%CV ≤80%。
阳性对照
分析批中使用阳性对照（包含目的基因片段的质粒或来自阳性细胞的基因组DNA等）来监控方法的稳定性。
定量下限
关于dPCR的定量下限（LLOQ），GCC白皮书（2021年）和2022年《生物分析白皮书》中之前关于50 copies /μg DNA的建议仍然适用，LLOQ的测定同时也应考虑仪器的理论%CV和背景gDNA量，以力求达到白皮书推荐的50拷贝/μg DNA灵敏度。
荧光校正
进行多通道检测时，各荧光通道之间可能会产生荧光串扰，此时可通过荧光校正实验（实验中包含negative control和单色阳性control）进行调节。
PART 04
数字PCR技术优势和展望
数字PCR技术在既往的研究中凸显出诸多优势：
➢ 反应和结果判读受扩增效率影响大大降低； ➢ 对PCR反应抑制物的耐受能力大大提高； ➢ 数字PCR实验中标准反应体系分配的过程可以极大程度上降低与目标序列有竞争性作用的背景序列浓度，适用于在复杂背景中检测稀有突变； ➢ 与传统荧光定量PCR相比，有更加出色的灵敏度、特异性和准确性，在极微量核酸样本检测、表达量微小差异鉴定、拷贝数变异检测等方面的应用已被广泛认可。
随着科学技术的不断进步，数字PCR系统正变得越来越灵活，性能在不断提高，多重检测与分析得到改善，相信数字PCR系统将很快进入临床诊断的应用，为生物研究提供更精准可靠得核酸分子检测与定量分析。
PART 05
熙宁生物|精翰生物PCR平台服务方案
熙宁生物|精翰生物基因检测平台配备了法国Stilla Technologies公司NaicaTM crystal全自动微滴芯片数字PCR仪系统（Nicia Geode微滴生成/扩增系统&Nicia Prism3微滴读取与分析系统），3色检测系统，兼容多重检测性能，灵敏度能够达到2拷贝每反应，可以从方法开发，方法验证，以及样本检测等方面提供一站式全方位的支持。
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