随着新的分子实体或者新的治疗方式首次进入人体，基于安全性考量，CD3 based双抗/多抗起始给药剂量较低，而较低的给药剂量对双/多特异抗体基于LBA PK检测方法的灵敏度需求提出了挑战。本文将以已上市的双特异抗体Blinatumomab (Blincyto)的生物学分析方法为案例，讨论双/多特异抗体基于结构-功能相关性原理；并以熙宁生物丨精翰生物采用的细胞平台高灵敏度的方法学为案例，提出在剂量爬坡阶段可采用Cell-based PK高灵敏分析方法作为解决方案，用于CD3 based双抗/多抗和mRNA递送双抗/多抗的PK分析。

目前在全球获批的双特异抗体药物有多款，Blinatumomab是其中最早之一，用于二线治疗费城染色体阴性，复发或者难治的急性淋巴细胞白血病（ALL）。Blinatumomab是Amgen公司基于其双抗平台bi-specific T-cell engagers (BiTEs)研发的双特异抗体。从结构上分析，Blinatumomab由一个抗CD19抗体的scFv（单链可变区片段）和一个抗CD3E抗体的scFv（单链可变区片段）通过柔性多肽共价偶联组成图1A, 其具体的氨基酸序列见下图2。从功能上分析，Blinatumomab能够同时结合ALL细胞表面的CD19抗原和T细胞表面的CD3E抗原，从而桥连T细胞接近ALL细胞，激活T细胞杀死ALL细胞图2B。

Blinatumomab由两个ScFv组成，缺少正常抗体的Fc端，无法通过Fc介导的FcRn内吞作用来延长半衰期，相对于常规抗体长达2-3周的消除半衰期，Blinatumomab的消除半衰期非常短，只有1.25 ± 0.63小时（见表1，患者使用手提式的微型泵和端口系统，以4周为一个周期进行15 μg/m2/d持续的静脉注射）。接下来本文将主要对Blinatumomab药代动力学的分析方法进行讨论。

Blinatumomab的药代动力学分析方法不同于以配体受体结合实验为平台的传统生物分析方法，其分析方法是基于其结构-功能相关性MOA机理，以细胞平台为基础建立起来。简略的过程如下：

Blinatumomab的细胞学生物分析方法是基于其结构功能特点，基于T细胞的激活需要刺激和共刺激信号。单纯的Raji或者Blinatumomab与T细胞孵育反应，均不能有效的激活T细胞导致T细胞细胞膜表面的CD69上调。只有采用Blinatumomab的抗CD19 ScFv一端桥接CD19+ Raji细胞, 抗CD3e ScFv一端刺激T细胞，才能利用B细胞共刺激激活T细胞，利用细胞膜标志物CD69进行检测。CD69在T细胞膜上的上调程度和Blinatumomab的药物浓度呈剂量依赖关系，从而起到定量分析的作用，该细胞学的生物学分析方法的定量下限能够达到100pg/ml。

熙宁生物|精翰生物自主构建了NF-AT报告基因Jurkat稳转细胞系来替代Blinatumomab生物分析方法中的T细胞，采用相同的Raji细胞和Blinatumomab抗体，建立了Blinatumomab的细胞平台的生物分析方法，通过激活Jurkat细胞检测报告基因luciferase的表达，检测化学发光信号值，Blinatumomab的剂量和化学发光信号值大小正相关，该定量方法的检测下限能够达到6.25pg/mL，LOD可达3pg/mL, 同时关键试剂仅需要标准品、现货靶细胞和效应细胞，无需制备抗双抗独特性抗体，可快速开展，节约项目准备周期。具体的数据如下图3：

基于熙宁生物丨精翰生物自主构建的靶细胞和效应细胞检测体系，高灵敏Cell-based 的PK生物分析方法能够检测到1ug级别给药剂量的PK血药浓度，对于有较高细胞因子释放风险的CD3 based双抗/多抗来说，是检测低至10pg/mL级别血药样品的最佳选择。目前已在多个mRNA递送双抗/多抗, CD3 based 双抗/多抗IIT和I临床项目进行应用，有成熟方法学体系。同时通过定制靶细胞系，可实现TAA是CD19，或者是任意实体瘤靶点，具备靶点的广谱适用性。方法学部分性能如下：

CLD18.2 CD3双抗 高灵敏度方法学

CD3 CD19双抗 方法学参数