前言

基因治疗的概念是在20世纪70年代初提出来的，最初的概念是引入一个正常的基因来取代一个突变基因，虽然现在有更多的替代方法，如基因编辑和碱基编辑，但它仍然是精翰生物高度依赖的主要策略之一。

基因治疗按照基因导入后的细胞培养模式可以分为“离体治疗”和“体内治疗”。“离体治疗”的操作对象是从病人身上分离的细胞，然后在体外经过改造和扩增再回输到体内达到治疗的效果，例如CAR-T治疗等。“体内治疗”操作时只需要把携带目的基因的病毒载体注入病变部位即可，理论上可以实现任意种类细胞的基因改造，不再像“离体治疗”那样受到细胞种类的限制，这是“体内治疗”相对“离体治疗”最大的优势，但在技术上真正实现任意细胞的基因改造目前还有一定难度，例如AAV病毒载体基因治疗。此外，“体内治疗”也省去了“离体治疗”的细胞收集、基因改造、培养扩增等繁琐的操作。

以AAV为载体的基因治疗药物在产品CMC阶段、临床前和临床阶段都会用到各种各样的生物分析手段。不同技术平台对AAV为载体的基因治疗药物提供了不同解决方案。

难点分析1：AAV基因治疗产品在CMC阶段需要考察多种质量属性，包括鉴别、含量/效价、纯度、杂质和安全性等多个方面。其中，含量和效价是最大的难点。精翰生物团队对基因组滴度、感染性实验都具有丰富经验。尤其在病毒滴度方面，开发出针对多种血清型的AAV基因组拷贝数滴度的定量检测方案，满足滴度测定的同时，也能考察病毒完整性。

精翰生物利用Naica数字PCR技术对重组腺相关病毒(rAAV)质粒载体和病毒基因组中ITR（CY5标记）、目的基因（GOI，HEX标记）和转录相关调控元件WPRE（FAM标记）三个不同基因位点同时拷贝数定量的方法进行优化，在数据分析中对不同病毒样品的前处理方案的条件进行阐述和比较，发现病毒样品的前处理方案中ITR发卡结构的线性化和衣壳蛋白的裂解条件对病毒基因组拷贝数定量的精确性影响尤为重要，为数字PCR方法在基因治疗病毒载体的质量控制体系中建立标准的检测方法提供依据。

Fig1、cdPCR检测WPRE/GOI/ITR 三靶标1D散点图

A图显示WPRE检测的1D散点图，B图显示GOI检测的1D散点图，C图显示Msp I酶切处理前ITR检测的1D散点图，D图显示Msp I酶切处理后ITR检测的1D散点图，蓝色表示WPRE阳性微滴群，绿色表示EGFP阳性微滴群，红色表示ITR阳性微滴群，灰色表示阴性微滴群。当WPRE或GOI比ITR越接近1：2，则产品的基因组更完整。

难点分析2：AAV基因治疗在临床前的组织分布和临床阶段的脱落研究。基于药物进入体内后会进入各器官，根据作用机理和治疗目的，在临床前研究组织分布，可以预测药物安全性，并指导临床方案。临床阶段的脱落分析将通过对患者给药后的排泄物进行测定。通常会包括荧光定量PCR反应和传染性试验开展。

精翰生物具有多款基因治疗药物，包括溶瘤病毒和不同血清型AAV基因治疗药物的临床前组织分布和临床阶段脱落研究经验。使用荧光定量PCR开展这两项检测时，需要合成特异性强和灵敏度高的引物和探针。多种组织样品和代谢物样品的DNA提取过程中可能会引物一些PCR抑制物，抽提过程中产物量的差异性都需考量。

Fig2、精翰生物在PK/脱落研究中的流程图

难点分析3：免疫原性是影响AAV基因治疗产品安全性和有效性的重要因素。AAV基因治疗在免疫原性的评估过程中不仅需要考虑体液免疫，还需要考虑细胞免疫。体液免疫检测内容可以为：抗衣壳蛋白抗体/中和抗体和抗表达产物抗体。使用的分析方法通常为LBA或者cell based assay。细胞免疫检测内容可以为：针对衣壳蛋白T细胞应答或针对表达产物抗体T细胞应答。无论是体液免疫还是细胞免疫，精翰生物拥有不同策略所开发的方法学和检测设备。同时利用完善的方法学可以开展在临床前研发阶段，AAV衣壳蛋白改造后临床前免疫原性评估。

精翰生物使用ELISPOT平台，已经开发和验证了基于ELISPOT技术检测人PBMC经CEF刺激后分泌IFN-γ的免疫细胞数的方法学，建立了较为完善的方法学开发验证体系。同时，正在开展了不同血清型AAV刺激PBMC后分泌INF-γ的免疫细胞数的方法学开发工作，根据AAV病毒载体血清型的不同，设计更具特异性方法学开发路径和验证方案。

Fig3、精翰生物在ELISPOT细胞免疫上的应用

1.选择合适的刺激物和免疫细胞（PBMC, B细胞, T细胞）作用加入ELISPOT板中。2. 培养孵育一段时间，使激活的免疫细胞分泌细胞因子。3. ELISPOT板已包被抗细胞因子的抗体，可以捕获在激活的免疫细胞周围分泌细胞因子。4.洗板去除细胞，加入二抗反应，酶联显色，激活的免疫细胞会形成较为规则的圆形斑点。

精翰生物拥有不同检测平台和技术手段，2022年中，熙宁I精翰搭建起了二代测序平台。精翰生物拥有设计合理、设施完备的独立的高通量测序实验室。实验室设计遵循高通量测序的具体检测流程和防治污染的原理。实验包括一个专用走廊，分区设计依次为试剂准备间、标本制备区、扩增一区、杂交捕获区/扩增二区、测序间和电泳间。实验室设备齐全且经过合理验证，目前实验室仪器有TC-96/G/H(b)B（基因扩增仪）、QuantStudio 5 Real-Time PCR Instrument （QuantStudioTM 5实时定量PCR仪）、Agilent 4150（片段分析仪）、Covaris M220（核酸打断仪）、E-Gel Power Snap（凝胶电泳系统）、Qubit（荧光计）、NanoPhotometer N60 Touch（超微量分光光度计）等，全面满足高通量测序实验需求。也为AAV基因治疗药物在CMC、临床前和临床阶段提供了更完善的服务需求。