大多数测定游离药物靶点的方法都是基于捕获试剂和抗体药物竞争与靶点结合的原理。测试方法的特异性和对靶标生物学的理解是建立可靠的游离靶标分析方法的关键。

临床前或临床阶段测定靶点可遵循以下先决条件：捕获抗体或检测抗体应与药物是否有竞争关系。

图a  总靶点与游离靶点检测方法对比

Total target：抗体对中两个抗体与药物均是非竞争关系。检测抗体及捕获抗体和药物结合靶点的位点均是不相同的。

Free target：抗体对中有且只有一个与药物是竞争关系。检测抗体与药物结合靶点的位点是相同的，而捕获抗体与药物结合靶点的位点是不同的；或捕获抗体与药物结合靶点的位点相同，而检测抗体与药物结合靶点的位点不同。

·   基质效应

检测中通过对样品高度稀释来减少未知来源的基质干扰，但此方式会引起靶点-药物复合物的解离并与检测试剂结合，这可能导致对游离靶点的潜在高估。此问题有两种解决方案：①开发较小稀释倍数或不稀释样本的分析方法；②稀释样本并恰当地报告结果。

如果可行，始终优先考虑方案①。然而在未稀释的样本中消除基质干扰是一项困难的工作，因为生物基质是复杂的，并且在血浆和血清中总蛋白浓度很高。

这里提供一种在未稀释或较小稀释的样本中消除基质干扰的思路，即使用不含内源性分析物的血清/血浆制备标准曲线，使标准曲线和样本具有相同的基质效应，以解决基质效应问题。

获得这种不含内源性分析物的基质最直接的方法是使用药物将所有待测物耗竭掉，并避免耗竭后过量的药物进入基质中。图b.一种使用磁珠耗竭基质中内源性靶点的方法举例。

这种方法可以有效的解决基质效应，但对操作要求较高，需要摸索各种试剂浓度。

图b  一种使用磁珠耗竭基质中内源性靶点的方法

步骤简述：

1）包被药物的磁珠耗竭基质中的靶点；

2）空磁珠耗竭过量的包被药物（否则药物会对靶点的检测有抑制作用）；

3）获得纯化后的基质（不含靶点，不含药物），用于配制标曲，从而获得了与真实样品组分相似的标曲，解决了基质效应。

·    药物-靶点分子复合物的解离

除稀释样品会造成对游离靶点的潜在高估外，另一个因素是，对于某些药物，给药后由于机体本身的代偿机制，机体会产生更多的靶点（total target显著升高），以弥补给药后靶点的亏损。由于药物-靶点复合物在检测过程中处于动态平衡转化的状态，导致方法检测出从复合物中解离出来的靶点，使游离靶点被高估。

为了进一步减少靶点从复合物中解离并在检测中产生的附加效应，可以在LBA分析之前，采用某些方式对样品进行预处理，以耗竭其中的药物或药物-靶点复合物，从而提高游离靶点的检测准确性。

对于双特异性抗体药物，可利用其对另一靶点的第二特异性选择性地耗竭药物或药物-靶点复合物，对于单克隆抗体药物，也可以使用靶点的非竞争型抗体耗竭药物或药物-靶点复合物。如图c.利用磁珠预处理样品的方法定量测定游离靶点A。

图c  利用磁珠预处理样品的方法定量测定游离靶点A

步骤简述：

1）利用抗药物另一端的抗体(抗-抗靶点B)或靶点B去耗竭样品体系中的药物以及药物-靶点A；

2）药物耗竭后的游离靶点A用free target方式进行检测。

PART 02

注：处理前，同一个样品经过不同倍数的稀释，浓度差异较大，基质干扰较大。

处理后，同一个样品经过不同倍数的稀释，浓度较为恒定，无基质干扰。

PART 03

使用耗竭待测靶点的空白基质有效地解决了基质效应问题，同时可以允许使用较低的MRD减少了靶点与药物的解离。

此外，通过耗竭样品中游离药物或药物-靶点复合物的方式可以对游离靶点进行准确定量，调整捕获试剂和样品孵育时间可以大大减少靶点分子从药物-靶点复合物中解离的机会，从而减少对游离靶点的潜在高估。

此游离靶点的定量方法稳健可靠、准确、精确并且无基质效应，可应用于临床前或临床阶段项目的研究。

熙宁生物 | 精翰生物在大分子生物分析领域有多年的项目经验（单双抗、细胞治疗、基因治疗和一些新型药物）。对于有难度的挑战性的方法学建立具备丰富经验，技术过硬，响应迅速，且在生物分析的同时，能从申办方角度对数据进行科学性的分析，并于临床需求进行关联分析，建立合规，科学，适用临床需求的方法。欢迎大家后台留言咨询交流。